Микробиология, вирусология, иммунология: Методические указания для самостоятельной работы и к практическим занятиям для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Часть III, страница 8

            Пластинчатая агглютинация.

            Пластинчатая реакция агглютинации ставится на гладкой поверхности стекла, фарфора. Поверхность пластинки должна быть тщательно обезжирена, чтобы хорошо растекалась капля сыворотки, физиологического раствора.

         Реакция применяется:  1) для серологической идентификации микробов на этапах бактериологического исследования и для окончательной серологической идентификации выделенных культур микробов кишечного семейства с помощью   поливалентных и монорецепторных сывороток; 2) для ускоренной серологической диагностики инфекционных болезней путем обнаружения антител, например при бруцеллезе (реакция Хеддльсона), туляремии.

Агглютинация на стекле относится к методам экспресс диагностики. V-антиген и иммунную сыворотку берут высококонцентрированными и взаимодействие между ними происходит при регулярном покачивании. Реакция наступает быстро, через несколько минут, что выгодно отличает ее от  реак­ции в пробирках.

Для постановки пластинчатой реакции на стекло наносят каплю цельной или слегка разведенной иммунной сыворотки, к ней добавляют каплю концентрированного антигена, в виде живой культуры, капли перемешивают петлей или легким покачиванием стекла. При положительном результате уже через несколько минут жидкость в капле просветляется, а по краям появляются хлопья склеившихся бактерий. Реакция сопровождается контролем антигена и антитела.

Существуют и другие варианты постановки реакции агглютинации: капельный, микроскопический, ускоренный по Ноблю.

Непрямая агглютинация.

Реакция агглютинации отличается высокой чувствительностью. Она положительна даже при содержании 0,1-0,01 мг антител в 1 мл. Чувствительность этой реакции может быть повышена, если увеличить массу и объем реагентов, адсорбируя их на поверхности инертных носителей. Носителями антигена или антител могут быть естествен­ные клетки: эритроциты, лейкоциты, бактериальные клетки, а также созданные искусственно: латекс, полистирол, бентонит, частицы угля. Основное требование, предъявляемое к носителям - возможность прочно соединяться с молекулами антигена или антитела и не давать спонтанной агглютинации. Такая реакция агглютинации называется непрямой агглютинацией. Различают несколько модификаций непрямой агглютинации:

а) Непрямая или пассивная агглютинация (РНГА, РПГА)

Носителем антигена или антител в этой реакции служат эритроциты. Нативные эритроциты животных (барана, обезьяны, морской свинки), птиц (петуха, гуся), человека 1 группы обладают способностью адсорбировать на своей поверхности полисахаридные молекулы, в том числе полисахаридные антигены бактерий, без предварительной обработки эритроцитов. Если же эритроциты обработать танином или трипсином, то на их поверхности будут адсорбироваться белковые молекулы, в том числе антитела, белковые антигены. Так как в лабора­торных условиях обработка свежих эритроцитов представляет определенные трудности, разработана методика сенсибилизации формалинизированных эритроцитов очищенными растворимыми антигенами микробных клеток или гамма-глобулиновой фракцией иммунной сыворотки. Эти препараты получили название эритроцитарных диагностикумов. Эритроцитарные диагностикумы являются стабильными препаратами и работа с ними упрощена. Реакция непрямой гемагглютинации используется для обнаружения антител в исследуемой сыворотке, которую разводят и разливают в лунки плексигласовой панели. Туда же добавляют равный объем соответствующего эритроцитарного диагностикума. Постановка реакции сопровождается контролями. Учет проводят после двух часо­вой экспозиции. Если антитела соответствуют антигену, они взаимодействуют между собой, внешним проявлением будет агглютинация эритроцитов, которая выглядит в виде рыхлого осадка с фестончаты­ми краями, занимающего большую часть дна лунки – «зонтик». Если же реакция отрицательная, то осадок эритроцитов имеет вид плотного диска в центре лунки с ровными краями – «пуговка».

Кроме того, реакция непрямой гемагглютинации может быть использована дня обнаружения растворимых антигенов с помощью известных антител, адсорбированых на поверхности эритроцитов.

РНГА по своей чувствительности и специфичности превосходит многие другие серологические реакции.

б) Латекс-агглютинация

Латекс-агглютинация - это реакция, в которой в качестве известного носителя используются частицы латекса. Латекс – водный раствор млечного сока каучуконосных деревьев или синтетических каучуков. Частицы латекса нагружают молекулами антигена или антитела и они приобретают способность склеиваться соответствующими анти­телами или антигенами. Если на латексе адсорбированы растворимые антигены, то эти частицы используются для обнаружения антител в исследуемой сыворотке и наоборот, если на латексе адсорбированы антитела, то частицы используют для обнаружения антигена. Чаще всего, метод используется для определения ревматоидного фактора или HBs-антигена.

Ставят реакцию на стекле, смешивая нагруженный антителами латекс и исследуемый антиген, при положительной реакции уже через 5 - 10 минут образуются видимые невооруженным глазом агглютинаты, которые затем увеличиваются в размере.

в) Реакция коагглютинации

В реакции коагглютинации в качестве инертного носителя используется культура золотистого стафилококка (штамм CowanI). Белок А, находящийся на поверхности оболочки этого стафилококка, способен связывать Fc-фрагмент иммуноглобулина G (Ig G1, G2, G4) оставляя свободными активные центры антитела. Эти центры взаимодействуют с соответствующими антигенами, вызывая склеивание стафи­лококков. Реакция применяется для обнаружения и типирования корпускупярных и растворимых антигенов. Для постановки реакции выпус­кают коммерческие стафилококковые реагенты (т.е. стафилококки нагруженные антителами диагностических иммунных сывороток). К реагенту добавляют 0,01 - 0,1 мл выделенной культуры, перемешивают покачиванием стекла и через 10 - 30 минут инкубации при комнатной температуре учитывают как обычную реакцию агглютинации.

ЗАНЯТИЕ 24

ТЕМА: РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ