Микробиология, вирусология, иммунология: Методические указания для самостоятельной работы и к практическим занятиям для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Часть III, страница 19

                           материал           или               материал          или             ткани               материал         или             в виде   

                                                  сыворотка                           сыворотка                                                     сыворотка     взвеси

                                                  реконва-                        реконвалесцентов                                      реконвалесцентов

                                                  лесцентов

                                   Чувствительное

                                         животное

                                    Куриные эмбрионы

Цель                   Выявление вируса или                   Идентификация вируса или                 Идентификация вируса или

                             выявление антител                              выявление антител                                  выявление антител                      

Схема 15

Реакция нейтрализации гемагглютинирующих свойств

 

Варианты                        Торможение гемагглютинации                                         Торможение гемадсорбции

реакции

Компоненты        Вируссодержащий    Сыворотка       Эритроциты        Иммунные сыворотки или        Клетки культуры

реакции                      материал           иммунная или     куриные или     сыворотка реконвалесцентов   ткани, зараженные

                                                           реконвалесцентов      других                                                                        вирусом

                                                                                            животных

Цель                        Определение прироста антител                                             Идентификация вируса

постановки             Определение типа вируса                                                      Определение прироста антител

которое вызывает дегенерацию 50% клеток. После этого разведения сыворотки смешивают с ранними объемами вируссодержащего материала в определенной дозе и после часовой экспозиции эту смесь вносят в пробирки с однослойной культурой ткани. Опыт сопровождается контролями: роста вируса, жизнеспособности клеток. Все пробирки помещают в термостат при 37°С, ежедневно просматривают пробирки,   через 4-6 суток учи­тывают результат. В опытных пробирках вирус будет нейтрализован антителами, и клетки культуры ткани будут нормальными, в контроле вируса произойдет дегенерация клеток. Титр сыворотки – это то наибольшее разведение сыворотки, которое предотвращает дегенера­цию клеток. Тип вируса определяют по типоспецифической сыворотке, предупреждающей развитие дегенерации и культуре ткани.

Цветная проба

         Цветная проба основана на способности вирусов изменять метаболическую активность зараженных клеток. Это определяют по цвету индикатора, содержащегося в питательной среде. В незараженных клетках выражен метаболизм, выделяются кислые продукты в пи­тательную среду, изменяя рН в кислую сторону и индикатор фенолрот из красного становится желтым. При заражении клетки вирусом в ней происходят дегенеративные изменения, активность метаболизма подавляется, цвет индикатора остается красным (не меняется). Специфические сыворотки, взаимодействуя с вирусом нейтрализуют его, клетки остаются жизнеспособными, метаболизм не подавлен, рН сдвигается в кислую сторону, среда желтеет.

Реакцию ставят на перевиваемых культурах клеток: HЕP-2, СОЦ, НЕLА и др.

Реакцию цветной пробы применяют для идентификации и дифференциации выделенных вирусов. Предварительно вирус титруют, опре­деляют цитопатическую дозу. Для этого готовят разведения вируссодержащего материала кратные 10 и определенный объем каждо­го разведения смешивает с равным объемом клеток в определенной дозе. После 5 суточного инкубирования при 37°С реакцию учитывают, определяют титр вируса. За титр вируса принимают то его наибольшее разведение, при котором наблюдается подавление метаболизма клеток (цвет индикатора в среде не изменяется).

После определения титра вируса смешивают  определенную его дозу с типоспецифической противовирусной сывороткой, инкубируют 1 час при комнатной температуре и этой смесью заражают взвесь клеток культуры ткани. Опыт сопровождается контролями. Все пробир­ки инкубируют в термостате от 4 до 9 дней. Изменение цвета индикатора в желтый говорит о нейтрализации вируса соответствующими антителами и позволяет определить вид вируса. Сохранение исходного цвета индикатора говорит о несоответствии вируса типу антител сыворотки.

Цветная проба для определения антител в сыворотке крови больных людей. Используются парные сыворотки для обнаружения прироста антител. Первую сыворотку берут в первые дни заболевания, вторую – на 15-20 день от начала заболевания. Сыворотки исследуют одномоментно, перед  постановкой реакции сыворотки прогревают при 56-60°С в течение 30 мин для разрушения термолабильных ингибиторов.

В качестве антигена используют вирусный диагностикум.

Таблица 12. Схема проведения цветной пробы.

Ингредиенты	1	2	3	4	5	6	7	8
							контроль
Сыворотка больного №1 в разведениях	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	с-ки	клеток
	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25 1:10	-
Питательная среда	-	-	-	-	-	-	0,25	0,25
Вирусный диагностикум одного из типов по 100 ЦПД50 на пробирку	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-	-
Взвесь клеток 300-400 тыс/мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Вазелиновое масло	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4