Изучение влияния различных факторов на амилолитическую активность ячменного солода, из приморских сортов ячменя, страница 4

Натрий углекислый безводный по ГОСТ 83, х.ч.

Кальций хлористый кристаллизованный

Термостатирующая баня ЛАБ-ТЖ-ТБ-01/12Ц 

pH-метр 213 (microprocessor pH meter, HANNA instruments)

Весы электронные «OHAUS» (Япония)

Реактивы Фелинга:

Приготовление раствора Фелинга I:

69,26 г перекристаллизованной сернокислой меди, не содержащей железа, взвешивали и растворяли в колбе вместимостью 1 л (Fischer et al. 1975).

Приготовление раствора Фелинга II:

399,76 г виннокислого натрия растворяли при слабом нагреве в 600 мл воды и фильтровали в мерную колбу вместимостью 1 л, куда затем приливали приготовленный отдельно раствор гидроокиси натрия (144,2 г гидроокиси калия растворяли в 200 мл воды). Объем раствора доводили водой до 1 л (Колчев и др. 1988;Коренман 2005).

2.3 Методы исследования

2.3.1  Выделение α -,  β – амилаз из ячменного солода

Навеску измельченного солода 20 г смешивали с 100 мл дистиллированной воды в фарфоровом стакане и беспрерывно перемешивали в течение 15 мин. Затем всю массу охлаждали в течение 30 мин в холодильнике. По истечении этого времени снова производили перемешивание, после чего массу отжимали через ткань и фильтровали через сухой складчатый фильтр. Вытяжка из солода содержала α- и β-амилазы.

α - Амилазу изолировали из вытяжки солода при следующих условиях: 10 мл солодовой вытяжки в пробирке прогревали на водяной бане при 70 ºС в течение 15 минут (указанная температура должна строго соблюдаться), после чего раствор охлаждали и брали на исследование активности α-амилаз.

β - амилаза при указанной температуре инактивируется. β-Амилазу изолировали из солодовой вытяжки путем инактивирования α-амилазы в кислой среде. Для этого поступали так: 15 мл солодовой вытяжки вносили в стаканчик, добавляли 3 мл раствора соляной кислоты с концентрацией 0,1 моль/л и 12 мл воды с тем, чтобы общий объем составлял 30 мл (рН при этом должен быть 3,3) и оставляли в холодильнике на 15 мин.

По истечении этого времени к раствору добавляли 6 мл раствора гидрофосфата натрия С(Na2HPO4) = 0,15 моль/л для того, чтобы довести рН до значения 6,0.

2.3.2 Определение редуцирующей способности фильтрата до инверсии

В коническую колбу вместимостью 250 мл приливали 50 мл фильтрата, а также последовательно по 25 мл растворов Фелинга I и II. После перемешивания колбу с раствором нагревали. Раствор кипятили 6 мин, считая с момента закипания. При этом выпадал красный осадок меди.

Для продолжения опыта нам был необходим выпавший осадок. Для предохранения закиси меди от окисления осадка постоянно должен был находиться в жидкости. В дальнейшем осадок закиси меди промывали несколько раз водой.

К промытому осадку закиси меди в колбу приливали небольшими порциями при постоянном перемешивании 30 мл раствора железоаммонийных квасцов, до полного растворения осадка.

По окончании промывания фильтрат с промывными водами титровали раствором маргонцовокислого калия до слабо-розового окрашивания, отмечали количество раствора пошедшего на титрование.

2.3.3 Определение редуцирующей способности фильтрата после инверсии

20 мл фильтрата приливали в коническую колбу вместимостью 250 мл. Закрывали колбу с фильтратом пробкой и нагревали в водяной бане до 65 ºС. Приоткрывая пробку, приливали в колбу 2,5 мл 7,3 н. раствора соляной кислоты для инверсии, жидкость перемешивали и держали в водяной бане при температуре 68 ºС.

Через 10 мин после внесения соляной кислоты колбу вынимали из водяной бани, быстро охлаждали до температуры 20 ºС.

После добавления одной капли раствора метилового оранжевого в колбу при непрерывном перемешивании приливали по каплям 1 н. раствор гидроокиси натрия до наступления слабокислой реакции.

После окончания нейтрализации в колбу с инвертируемым раствором приливали последовательно пипеткой по 25 мл растворов Фелинга I и II и далее проводили определение редуцирующей способности фильтрата по методу Бертрана описанному выше. 

2.4 Определение физико-химических характеристик амилолитических ферментов ячменного солода

2.4.1 Изучение влияния рН на декстринирующую способность амилазы

Для изучения влияния рН на активность амилазы готовили серию растворов. Для этого в 10 пробирок наливали по 2,5 мл буферных растворов, состоящих из следующих количеств 0,2 М раствора Na₂HPO₄ и 0,1 М лимонной кислоты (таблица 3).