Основы теории рентгенографических исследований. Физические принципы рентгеноструктурного анализа глобулярных белков (Разделы 1-2 учебного пособия "Рентгенография биологических объектов"), страница 8

Если тяжелый атом обладает значительной электронной плотностью, то происходит существенное изменение рентгенограммы (рис. 2.7). Различие интенсивностей рефлексов на дифракционных картинах нативного белка и его производных можно использовать для решения фазовой проблемы, если известно положение присоединенного тяжелого атома. Если кристалл является центросимметричным (т.е. каждому атому в положении x, y, zотвечает атом в положении -x, -y, -z), то для однозначного определения фаз требуется одно тяжелоатомное производное. В случае нецентросимметричных кристаллов белка нужно использовать несколько тяжелоатомных производных, так как одно такое производное не позволяет определить все фазы отражений. В этом случае говорят о так называемом многократном изоморфном замещении.

Рис. 2.7. Рентгенограммы кристаллов нативного белка фосфорилазы (а)

и тяжелоатомной производной этого белка – этилмеркуртиосалицилата фосфорилазы (б)

В методе изоморфного замещения можно условно выделить пять стадий.

1. Получение тяжелоатомных производных.

2. Измерение интенсивностей рефлексов рентгенограмм нативного белка и его тяжелоатомных производных.

3. Обработка данных и внесение поправок в интенсивности рефлексов.

4. Определение положения тяжелых атомов.

5. Определение фаз.

Далее рассмотрим основные положения теории метода изоморфного замещения.

Обозначим через  структурный фактор нативного белка, который является вектором и характеризуется структурной амплитудой F_Р и фазой . Аналогично для тяжелоатомного производного вектор  - структурный фактор, имеющий амплитуду F_PH и фазу . Векторы  и  связаны между собой следующим соотношением:

,                                          (2.17)

где вектор  характеризует вклад тяжелых атомов в структурный фактор тяжелоатомного производного (рис. 2.8).

Рис. 2.8. Векторная диаграмма, показывающая вклады

нативного белка () и тяжелого атома  в структурный фактор

тяжелоатомного производного белка

Зная величины структурных амплитуд F_PH и F_P (их можно измерить), а также расположение тяжелых атомов в элементарной ячейке, можно найти вектор  и затем - фазу . Она определяется следующим соотношением:

,               (2.18)

которое можно получить, используя теорему косинусов из рис. 2.9. Указанное соотношение свидетельствует о том, что имеется два возможных значения , которые в случае одного изоморфного производного нельзя различить. Неопределенность устраняется только в том случае, если векторы  и  коллинеарны.

Рис. 2.9. Схема, характеризующая структурные амплитуды и фазы,

используемые в тексте

Указанную неопределенность можно проиллюстрировать графически, если использовать построение, показанное на рис. 2.10, которое предложил Харкер. Из центра О проводят вектор -. Затем строят окружность радиусом F_PH с центром J в конце вектора -. Вторая окружность радиусом F_P имеет своим центром точку О. В общем случае имеются две точки пересечения этих окружностей G и H. Отрезки OG и OH соответствуют двум возможным положениям вектора . Они расположены симметрично относительно вектора . Если векторы  и  коллинеарны, то имеется только одна точка, в которой окружности касаются, и решение однозначно.

Рис. 2.10. Построение Харкера для расчета фаз методом

одного изоморфного замещения, которое соответствует рис. 2.9

Отметим, однако, что метод однократного изоморфного замещения применим к нецентросимметричным структурам, если тяжелые атомы не находятся в частных положениях или не связаны центрами симметрии. Этим методом можно получить карту электронной плотности белка, но из-за высокого уровня фона он редко используется в кристаллографии белка.

Обычно положения тяжелых атомов неизвестны, т.е. вектор  нельзя построить. Однако структурные амплитуды F_PH и F_P позволяют оценить величину F_H. Можно показать, используя рис. 2.9, что если величина F_H мала по сравнению с величинами F_PH и F_P, то имеет место приближенное соотношение

.                    (2.19)

Когда векторы  и  коллинеарны, то . Если же структурная амплитуда F_H будет большой, то может иметь место следующее соотношение: .

После оценки величины F_H ее значение используют для определения положений тяжелых атомов. Для приближенного определения этих положений используется метод Паттерсона, а для уточнения положений - разностные синтезы Фурье.

В первом методе используется функция Паттерсона, которая является преобразованием Фурье интенсивности  рассеянного излучения, получаемой из эксперимента:

.           (2.20)

Максимумы функции Паттерсона приблизительно пропорциональны произведению атомных номеров z_iz_j и, если расстояния r_ij повторяются в структуре, числу этих повторений. Для тяжелого атома величина z_i велика и поэтому будет большим соответствующий максимум функции Паттерсона. Эта функция позволяет определять структуру относительно простых соединений. В случае сложных структур белков вероятность обнаружений каких-либо деталей структуры очень мала. Тем не менее, правильная интерпретация функции Паттерсона очень важна в кристаллографии белка, так как функция  содержит структурную информацию. В связи с этим метод Паттерсона составляет основу локализации тяжелых атомов в тяжелоатомных производных кристаллов белков.

Разностные синтезы Фурье используются для определения координат тяжелых атомов, если из изучения других тяжелоатомных производных известны оценки фаз белка. В качестве коэффициентов в этих синтезах используются следующие выражения:

,                                     (2.21)

которые характеризуют векторный вклад тяжелого атома в направлении структурного фактора белка, заданного фазой . Величина m называется показателем достоверности и используется в качестве веса. Она теоретически представляет среднее значение косинуса погрешности фазового угла и равна 1 для ошибки фазового угла, равной 0. Если же ошибка равна примерно 42⁰, то m=0,74, а в случае ошибки в 76⁰ - m=0,24.