Основы теории рентгенографических исследований. Физические принципы рентгеноструктурного анализа глобулярных белков (Разделы 1-2 учебного пособия "Рентгенография биологических объектов"), страница 11

Таким образом, имеются две возможные фазы , то есть определение фазы не является однозначным. Графически наличие двух возможных фаз показано на рис. 2.14, где представлена диаграмма, построенная тем же способом, что и в случае метода изоморфного замещения. На рис. 2.14 показаны две окружности с радиусами  и , которые имеют центры в точках  и , определяемых концами векторов  и . Две точки пересечения этих окружностей М и Н соответствуют двум возможным векторам , которые представлены отрезками JМ и JН.

Рис. 2.13. Структурные факторы прямого

 и инвертированного отражений

Рис. 2.14. Диаграмма Харкера, иллюстрирующая определение фаз

с помощью аномального рассеяния

Для того чтобы устранить неоднозначность в определении фазы , результаты, полученные на основе данных по аномальному рассеянию, дополняют информацией, даваемой методом изоморфного замещения. Так как на основе метода изоморфного замещения можно определить , а в случае аномального рассеяния – , то для однозначного определения фазы белка  объединяют информацию обоих методов. Графически это показано на рис. 2.15, где приведены три окружности с радиусами ,  и , которые пересекаются в одной точке Н и однозначно определяют вектор .

Рис. 2.15. Диаграмма Харкера, иллюстрирующая определение фаз с помощью аномального рассеяния в сочетании с изоморфным замещением

Если изменять длину волны рентгеновского излучения, то будут изменяться действительная и мнимая части структурного фактора аномального рассеяния. Особенно сильные различия наблюдаются в области края поглощения аномального рассеивателя. Поэтому волны разной длины приводят к возникновению различий на дифракционных картинах, которые могут быть использованы для расчета фаз белка методом, полностью эквивалентным методу изоморфного замещения.

В этом случае, если известно положение аномального рассеивателя, может быть рассчитан вектор, соответствующий различию аномального рассеяния для двух длин волн. Далее, если считать, что остальные атомы аномально не рассеивают, можно получить информацию о фазах нативного белка способом, аналогичным методу изоморфного замещения.

Итак, в этом методе изменения дифракционных картин при изменении длины волны эквивалентны изменениям, обусловленным изоморфным замещением. Следует отметить, однако, что кристаллы в этом случае строго изоморфны. Поэтому, хотя различия в интенсивностях в этом случае будут меньше, чем при изоморфном замещении, отсутствие систематических погрешностей, связанных с нарушением изоморфизма, компенсирует этот недостаток.

При использовании данного метода рекомендуется тщательный подбор излучения, чтобы добиться максимального различия в дифракционных картинах, зарегистрированных при применении различных длин волн. Кроме того, необходимо внесение поправок на поглощение, так как оно будет различным на двух длинах волн. Также важно одно и то же отражение на разных длинах волн измерять практически одновременно или в течение небольшого интервала времени.

Описанные выше методы определения фаз в случае как изоморфного замещения, так и аномального рассеяния относятся к идеальным условиям, которые, вообще говоря, не реализуются на практике. Это связано с погрешностями или ошибками, источниками которых являются следующие факторы: неточность измерения интенсивностей, нарушение изоморфизма и неточность определения положений тяжелых атомов. Это приводит к тому, что три окружности на рис. 2.11 и 2.15 не будут пересекаться в одной точке. Следовательно, вновь появляется неопределенность в нахождении фаз, для решения которой необходимо анализировать ошибки. Поэтому в действительности нужно оценивать ошибку определения каждой фазы, что является довольно сложной проблемой, и рассмотрение ее выходит за рамки данного пособия.

В результате анализа ошибок определяют так называемые лучшие фазы () и показатель достоверности m. Тогда расчет электронной плотности  производится по формуле (2.16), в которой в качестве коэффициентов используются выражения , где  - амплитуда структурного фактора .

Итак, точный математический расчет функции  невозможен из-за неизбежных погрешностей в амплитудах и фазах. Принципиальным также является ограничение, обусловленное обрывом ряда Фурье, определяемое минимальным межплоскостным расстоянием (), которое находится как

,                                                                                                  (2.35)

где  - максимальное значение  для отражений, включенных в ряд Фурье. Это минимальное межплоскостное расстояние в кристаллографии белка характеризует номинальное разрешение, с которым определена структура белковой молекулы. Поэтому разрешение величиной 6 Å считается низким, а соответственно 2 Å - высоким. Величины 6 Å и 2 Å характеризуют предельные межплоскостные расстояния, которые использованы в синтезе Фурье. Разрешаются ли на картах электронной плотности детали такого размера, зависит от многих факторов, среди которых отмечаются, например, степень изоморфизма тяжелоатомных производных, степень упорядоченности кристалла, точность измерения интенсивностей.

Можно указать, что разрешение, которое можно достичь для кристаллов белков, ограничено неупорядоченностью молекул, связанной с тепловыми колебаниями и имеющей статистический характер. Реализуемое разрешение зависит от качества отражений при приближении к , а также от точности вычисленных фаз и редко достигает величины .

По расчетным данным функцию электронной плотности  изображают в виде карт электронной плотности, на которых линиями соединяют точки, имеющие одинаковое значение . Такие карты представляют собой сечения плоскостями трехмерного распределения электронной плотности. Положениям атомов на них соответствуют максимумы электронной плотности.