Наибольшую массу гриба получают при выращивании с аэрацией в жидкой среде. Простым методом аэрации является встряхивание па качалке при 120—180 об/мин. Для этого в колбу емкостью 0,5 л с 150 мл жидкой питательной среды вносят 3 мл густой суспензии гриба и выращивают при 28 °С. Большинство грибов дают достаточное количество мицелия на 7-й день.
Широкое распространение получило выращивание с вихревой аэрацией. При этом методе культуральную среду быстро вращают, отчего воздух внедряется в нее вблизи вершины воз душной воронки.
Выросшие культуры патогенных грибов инактивируют теплом, фенолом, формалином, мертиолатом или другими антисептиками. Мицелий отфильтровывают на воронке Бюхнера, покрытой капроновой сеткой, промывают охлажденным до 2-6 °С 0,9 % раствором хлорида натрия и отжимают между листами фильтровальной бумаги. Культуры дрожжеподобных грибов отмывают в центрифуге охлажденным 0,9 % раствором хлорида натрия, для получения иммунных сывороток используют иммунизацию животных.
РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА)
В микологической практике РА применяют в основном для серодиагностики заболевания, реже - для идентификации культур дрожжеподобных грибов. Для постановки РА в пробирках готовят ряд серийных двукратных разведений сыворотки в 0,9 % растворе хлорида натрия в объеме 1 мл и добавляют по 0,1 мл диагностикума. К реакции ставят контроль антигена (1 мл изотонического раствора + 0,1 мл диагностикума).
Пробирки в штативе встряхивают и инкубируют 2 ч при 37 С, а затем 18-20 ч при 4-6 С. После этого пробирки слегка встряхивают и учитывают реакцию на темном фоне. При появлении в контроле антигена спонтанной агглютинации реакцию не учитывают.
РА с центрифугированием является ускоренным методом исследования. Титром антител считают наивысшее разведение сыворотки, дающее ясно различимую невооруженным глазом агглютинацию.
Реакция связывания комплемента. Реакция связывания комплемента с успехом применяется при диагностике грибковых заболеваний. Она отличается достаточной чувствительностью и специфичностью. Результаты реакции во многом зависят от качества применяемых антигенов.
РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)
Для реакции используют эритроциты, на которых адсорбированы антигены грибов: такие эритроциты агглютинируются в присутствии противогрибковых сывороток. С помощью РНГА удается обнаружить даже незначительные количества специфических противогрибковых антител
РНГА ставят обычно в панелях из органического стекла с U-образными лунками микротитратора Такачи или в пробирках. Исследуемые сыворотки разводят 1:10 изотоническим раствором хлорида натрия и прогревают при 56 C 30 мин, затем готовят разведения исследуемой сыворотки в 1 % растворе НКС в лунках панели и добавляют равный объем 1 % суспензии сенсибилизированных эритроцитов. Для исключения неспецифических реакций ставят контроль сенсибилизированных эритроцитов (1 % НКС + 1 % суспензия эритроцитов). Если РНГА применяют для обнаружения антигена в субстратах, то дополнительно ставят контроль исследуемого материала
(материал + несенсибилизированные танизированные или формалинизированные эритроциты) и контроль со специфическим антигеном (специфический антиген в разведениях до титра + 1 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов). Панели оставляют при 37°С или 22°С (в зависимости от рекомендации по использованию конкретного диагностикума). Результаты учитывают через 1,5—2,5 ч (или после осаждения эритроцитов в контроле). При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно лупки в виде плотного диска или маленького колечка с ровными краями. При положительной реакции образуется рыхлый осадок эритроцитов с фестончатыми краями, покрывающий все дно лунки. Снижение интенсивности реакции выражается в уменьшении размера рыхлого осадка и формировании плотного осадка эритроцитов.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.