Экспериментальная иммунология: задачи, объекты и методы. Иммунизация и ее возможности при исследовании иммунной системы. Серологический метод исследования и его использование в иммунологии и смежных областях, страница 9

1. Анафилактогенность исследуемого препарата (сенсибилизирующие свойства)

Основной принцип – исследуемый препарат вводят животным (морским свинкам, реже – мышам, крысам или кроликам) вместе с адъювантом Фрейнда для индукции сенсибилизации (иммунного ответа). На высоте сенсибилизации (21 сутки) вводят разрешающую дозу исследуемого препарата, регистрируя внешние признаки анафилаксии (частота дыхания, почесывание, дефекация, мочеиспускание, дрожь, судороги, смерть).

Проведение исследований требует постановки 2 контролей: позитивного (моделирование анафилактического шока) и негативного. Формирование позитивного контроля проводят с помощью введения лабораторным животным чужеродного белка (яичного альбумина – овальбумина, либо лошадиной сыворотки крови), т.е. проводят иммунизацию животных контрольной группы по разработанной схеме. При этом применяются схемы иммунизации (свойства антигена, дозы антигена, кратность введения, способы введения), которые наиболее эффективны в инициации гуморального иммунного ответа с выработкой антител класса IgE.

Схема эксперимента. 3 группы животных – 1 опытная (соответственно двум исследуемым дозам – две группы), 2 контрольные (негативный и позитивный контроль)

             Анафилактическая реакция обычно наступает через 1-2- минуты после введения разрешающей дозы антигена. Её оценку проводят по внешним признакам по четырехплюсовой системе:

+ - кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти, падение температуры тела (не менее чем на 1 °С),

++ - четко выраженное почесывание, единичные чихания, падение температуры тела,

+++- спастический кашель, боковое положение животного, дефекация и мочеиспускание,

++++ - спазм дыхательной мускулатуры, конвульсивные прыжки, судороги, гибель животного.

2. Активная кожная анафилаксия

Основной принцип – исследуемый препарат вводят животным (морским свинкам или мышам СВА или Balb/c) в режиме сенсибилизации, затем вводят разрешающую дозу строго внутрикожно. Одновременно внутривенно или в ретроорбитальный синус вводят раствор синьки Эванса, которая, диффундируя по кровотоку, наиболее активно задерживается в кожных покровах в местах развития сенсибилизации, т.е. в точках, куда вводили антиген. После умерщвления животного оценивают площадь прокрашенного кожного лоскута.

Схема

Другой способ учета реакции. Окрашенный участок кожи вырезать и поместить в пробирку с 1 мл 1N раствора КOH, инкубировать 12 – 14 часов при температуре +37 °С. Затем в пробирку вносят 9 мл лизирующей смеси (0,6N раствор H₃PO₄ и ацетон в соотношении 5 : 13). Пробирку встряхивают и центрифугируют. На спектрофотометре определяют оптическую плотность супернатанта при 620 нм. Одновременно строят калибровочный график с образцами, содержащими 2 – 10 мкг красителя в мл лизирующей смеси. По калибровочному графику определяют содержание красителя в участке кожи животного.