Исследования проведены на 42 самцах мышей линий CBA и С57Bl/6g шести-, семинедельного возраста, с массой тела 20-25 г, что предполагает изучение детерминации генотипа животных на особенности ответа. В работе использовали штаммы вирусов гриппа A А/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (Н5N1) в дозе 5 МЛД50 в объеме 50 мкл инфицирующей жидкости и A/California/04/2009 (H1N1) – в дозе 5,38 lgТЦПД50/мл в объеме 50 мкл инфицирующей жидкости.
Животные каждой линии были разделены на 3 группы: первая группа служила контролем и была представлена 3 интактными мышами, животных второй группы инфицировали штаммом вируса гриппа A подтипа H5N1 A/Gs/Krasnoozerskoye/627/05, животных третьей группы инфицировали штаммом вируса гриппа A подтипа H1N1 A/California/04/2009. Заражение проводили интраназально дозой МЛД50 (мышиная летальная доза, применение которой вызывает гибель 50% животных). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде.
Образцы тканей легких и головного мозга для исследования получали через 1, 3 и 6 суток после заражения от 3-х мышей на каждом сроке каждой линии после выведения их из эксперимента (под эфирным наркозом путем дислокации позвонков в шейном отделе). Быстро извлеченные органы иссекали, кусочки тканей фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 4 ч при температуре 4°С, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50°, 70°, 96°, абсолютный), смеси ацетона и абсолютного спирта и завершали проводку в ацетоне. Образцы ткани заливали в смесь аралдита-эпона (1:6) с добавлением катализатора DMP-30, полимеризацию проводили сначала при комнатной температуре, далее в термостате при 60°С. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме UC-6 (пр-во Leica, Германия). Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором метиленового синего и использовали для ориентировки на срезе при затачивании пирамидки. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным раствором уранилацетата и раствором Рейнольдса и изучали в электронном микроскопе JEM 100 CХ (Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV.
3.1. Ультраструктурное исследование особенностей топологии вируса свиного гриппа субтипа H1N1 (штамм A/California/04/2009) и вируса гриппа птиц H5N1 (штамм A/goose/Krasnoozerskoye/627/05) в альвеолоцитах и макрофагах легких и головного мозга.
Иследование тканей легких под электронным микроскопом уже через сутки после заражения мышей обеих линий и штаммом А/H1N1, и штаммом А/H5N1 выявило появление вируса в альвеолярном эпителии, эндотелии легочных капилляров и просвете альвеолярных мешков (рис. 1-3). Встречаются вирионы овальной и цилиндрической формы, а также незрелые вирусные частицы, представляющие собой капсиды. Наличие вироплазмы в ядрах и цитоплазме клеток, а также отпочковывающиеся вирионы свидетельствуют о репродукции вируса в тканях легких – альвеолоцитах и эндотелиальных клетках уже на начальных стадиях заболевания (рис. 1-4).
Отличительной особенностью клеток, инфицированных вирусом А/H5N1, являются многочисленные скопления вироплазмы в ядрах и цитоплазме клеток легочной ткани. Однако, в цитоплазме клеток лекгих животных, зараженных вирусом А/H1N1 значительно чаще встречаются картины формирования нуклеокапсидных белков на профилях эндоплазматической сети.
К третьим суткам визуально увеличивается количество клеток с вироплазмой, формирующимися нуклеокапсидами, отпочковывающимися вирионами у всех исследуемых животных (рис. 5-9). В области гранулярной эндоплазматической сети альвеолоцитов и цитоплазматических свободных полисом отмечаются мелкогранулярные и фибриллярные осмиофильные скопления капсидных белков (рис. 5Б-8). Вирус штамма А/H5N1 появляется во многих паренхиматозных и стромальных структурах легких, зараженных им мышей.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.