Основные принципы и диагностические возможности проточной цитометрии в клинической иммунологии и эндокринологии, страница 4

Для обоих вариантов окрашивания основная процедура одна и та же. Клетки инкубируют с насыщающими концентрациями реагентов в течение 30 минут, а затем отмывают от несвязавшихся агентов. Для определения оптимального при окрашивании количества реагентов (например МКА) проводят предварительные эксперименты. При этом сводятся к минимуму эффект неспецифического окрашивания и ошибка в дозировке соответствующих реактивов.

Необходимо отметить, что прямые меченые флюоресцеином МКА являются предпочтительнее, когда анализируются клеточные поверхностные антигены. Так как, прямые и непрямые методы связаны с различным порогом распознавания, результаты, полученные при проведении этих анализов сопоставлять некорректно.

Определение различных субпопуляций лимфоцитов

Как правило, в практике большинства клинико-диагностических лабораторий используется “укороченная” панель моноклональных антител для выявления  следующих поверхностных дифференцировочных антигенов: для определения зрелых Т-лимфоцитов – CD3, Т-хелперов/индукторов – CD4, Т-цитотоксических лимфоцитов – СD8, В-лимфоцитов – СD19, натуральных киллеров (NK-клетки) – СD16, моноцитов/макрофагов – CD14 (табл. 2).

Таблица 2

Нормативные показатели иммунофенотипирования клеток иммунной  системы периферической крови здоровых людей [3]

Первоначально рассмотрим характеристику и диагностическую значимость маркеров, входящих в состав укороченной, основной панели. Более детальный анализ состояния иммунного статуса проводится с помощью дополнительной панели моноклональных антител. Характеристика CD-маркеров, включенных в эту панель, также будет приведена ниже.

Дифференцировочные антигены Т-лимфоцитов

Основная панель

 СD3 – маркер позволяет идентифицировать зрелые покоящиеся  (интактные) Т-клетки и подсчитать общее количество Т-лимфоцитов. Количественная оценка субпопуляции CD3-лимфоцитов имеет диагностическую значимость в следующих случаях:

·  первичных и вторичных иммунодефицитах;

·  острых вирусных инфекциях, включая ВИЧ-инфекцию;

·  внутриклеточных бактериальных и паразитарных инфекционных заболеваниях  (например, туберкулез, лепра, лейшманиоз);

·  злокачественных новообразованиях;

·  реакциях отторжения трансплантатов и болезни трансплантат против хозяина;

·  лимфопролиферативных расстройствах (острый Т-лимфобластный лейкоз).

Для оценки функциональной активности этой субпопуляции лимфоцитов применяется реакция бласттрансформации  (РБТЛ) с использованием Т-клеточных митогенов : фитогемагглютинина (ФГА) и конканавалина А (Кон А).

При сахарном диабете довольно часто наблюдается снижение у больных  процентного содержания и абсолютного числа СD3-лимфоцитов.

СD4

Использование МКА к CD4 антигену дает возможность количественно  охарактеризовать особый клон клеток, получивших название Т-хелперов/индукторов.  СD4-клетки в функциональном отношении делятся на два вида хелперных лимфоцитов: Т-хелперы  1 порядка (Th1-клетки) и 2-го порядка (Th2-клетки). Различные CD4 Т-клетки продуцируют разные наборы цитокинов. Th1-клетки (их называют еще клетками гиперчувствительности замедленного типа – ГЗТ) – цитокины для клеточного иммунного ответа: интерлейкин 2 (ИЛ-2), ИЛ-3, γ-интерферон, ФНОα, ФНОβ, среди которых дискриминантным цитокином является γ-интерферон. Th2 секретируют набор цитокинов, необходимый для гуморального иммунного ответа: интерлейкины 3, 4, 5, 6, 10, 13, ФНОα, среди которых дискриминантным цитокином является ИЛ-4.