Практикум по физической химии. Лабораторные работы: Методическое пособие, страница 13

3.   Калий фосфорнокислый однозамещенный;

4.   Натр едкий, раствор;

5.   Калий иодистый;

6.   Раствор глюкозооксидазы (хранится в холодильнике).

НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ:

1.   Спектрофотометр SPECORD UV VIS или аналогичный;

2.   рН-метр;

3.   Автоматические микропипетки на 5 (10, 20) мкл;

4.   Автоматическая микропипетка с переменным объемом на 200 мкл.

Экспериментальная часть

 Измерение скоростей ферментативной реакции проводят непосредственно в кювете спектрофотометра. Для этого в кювете смешивают приготовленные заранее реагенты (КI-реактив, раствор глюкозы, буфер), термостатируют до нужной температуры. Реакцию начинают добавлением аликвоты фермента (5–10 мкл), немедленно интенсивно перемешивают и записывают кинетическую кривую. Регистрация длится 1–5 мин в зависимости от количества добавленного фермента.

Каждый эксперимент воспроизводят 2–4 раза.

Приготовление растворов

Приготовление 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,0

·  Провести калибровку рН-метра по стандартному раствору с рН 6,86 при 25 ⁰С.

·  1,71 г калия фосфорнокислого однозамещенного растворить в дистиллированной воде в стакане объемом 200 мл. Довести рН полученного раствора до значения 6,0 на рН-метре с помощью раствора едкого натра. Перенести содержимое стакана в мерную колбу на 250 мл, довести до метки дистиллированной водой.

Приготовление  KI-реактива

·  KI-реактив должен быть свежеприготовленным.

·  0,83 г калия иодистого растворить в 8 мл буферного раствора рН 6,0, добавить 2 мл 9%-ного раствора молибдата натрия, перемешать. Использовать в течение одного занятия.

Приготовление 10%-ного раствора D-глюкозы

1 г D-глюкозы растворить в 10 мл буферного раствора, выдержать не менее 2 часов для протекания реакции мутаротации с образованием эквимолярной смеси a- и b-D-глюкозы.

Изучение кинетики реакции при различных концентрациях глюкозы в растворе

Запись кинетических кривых проводят на спектрофотометре при постоянной длине волны l = 350 нм.

В кварцевую кювету толщиной 1 см помещают 0,5 мл  КI-реактива, затем добавляют 10%-ный раствор глюкозы и буферный раствор рН 6,0 в следующих пропорциях:

10% р-р глюкозы, мкл	10	20	50	100	200	400	1000
буферный раствор, мл	1,5	1,5	1,45	1,4	1,3	1,1	0,5

Термостатируют кювету при 25 С в течение 10–15 мин.

Автоматической микропипеткой вносят 5 (или 10) мкл раствора глюкозооксидазы, интенсивно перемешивают и записывают кинетическую кривую. Опыт воспроизводят 2–4 раза.

Обработка экспериментальных данных, расчет кинетических параметров

Из кинетических кривых определяют начальную скорость окисления глюкозы, равную скорости выделения перекиси водорода в ферментативной реакции. Концентрацию перекиси водорода в свою очередь определяют по реакции с KI-реактивом

Н₂О₂ + 3I^– + 2Н⁺ ® 2Н₂О + I₃^–,

в результате которой образуется I₃^–, имеющий максимум поглощения при 350 нм с коэффициентом экстинции e = 2,5´10⁴ л/моль×см.

Строят график зависимости начальной скорости реакции W_о, выраженной в мкмолях выделившейся перекиси водорода в 1 мин на 1 мкл раствора фермента, от начальной концентрации субстрата в растворе S₀, моль/л. Обработку экспериментальных данных проводят графически в обратных координатах Лайнувера–Берка        1/W₀ – 1/S₀ (уравнение 1), а также Корниш–Боуден W₀ – W₀/S₀ (уравнение 2).

                                             (уравнение 1),

                                                (уравнение 2).

     Из полученных графиков вычисляют константу Михаэлиса по глюкозе К_М и максимальную скорость реакции W_max в данных условиях.

Задача Г-3

ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ ОКСИДА АЗОТА КИСЛОРОДОМ МЕТОДОМ ОПТИЧЕСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Окисление оксида азота молекулярным кислородом до диоксида протекает как тримолекулярная реакция.