Основные принципы и диагностические возможности проточной цитометрии в клинической иммунологии и эндокринологии, страница 3

Для иммунофлюоресцентного мечения используется целый ряд флуорохромов, таких как: флуоресцеинизотиоцинат (FITC), тетраметилродамин (TRITC), фикоэритрин (PE), белок хлорофилла – перидинхлорофилл протеин (PerCp),  алло-фикоцианин (АРС), тандем цианин-5/фикоэритрин  (Cy5/PE)  и другие. В настоящее время наиболее распространенным является использование двух-, трех- и даже четырех-цветной метки при наличии второго источника света. При воздействии на них лазерным лучом флуоресцентные красители, входящие в состав таких реагентов, генерируют различные цвета, что позволяет определять два или три антигена одновременно. С этой целью современные модели цитометров, как правило, оснащены четырьмя фотоумножителями с высокой разрешающей способностью на следующих волнах 530 нм (FITC), 585 нм (фикоэритрин-пропидиум иодид), 661 нм (АРС), свыше 650 нм (PerCp), в случае опции второго лазера – выше 670 нм (РеrCp, Cy5/PE).

Распознавание порога антигенной экспрессии является различным для каждого флуорохрома. Для выявления антигенов со слабой экспрессией (CD13, CD19 или СD33), используются, как правило, моноклональные антитела, коньюгированные с ярким флуорохромом PE  или менее ярким Cy5/PE. Антигены с сильной экспрессией (CD45, HLA-DR)  могут быть проанализированы с помощью димерконьюгатов, подобных FITC и PerCp.

В табл. 1 приведены наиболее часто используемые флуорохромы.

                                                                                                                                                               Таблица 1

Флуорохромы, используемые для проточно-цитометрических измерений

Процедура окрашивания может быть выполнена с использованием как прямых коньюгированных с флуохромом антител, так и с помощью  реакции непрямой иммунофлуоресценции. Прямое окрашивание включает инкубацию клеток с флуорохром-коньюгированным реагентом, специфичным по отношению к исследуемому клеточному маркеру. Непрямое окрашивание предполагает два этапа. Сначала клетки обрабатывают реагентом, специфически взаимодействующим с выявляемым поверхностным и цитоплазматическим антигеном, а затем добавляют коньюгированный с флуорохромом агент, специфически связывающийся с реагентом, использованным на первом этапе. Для этих целей обычно используют биотин и авидин, являющиеся нефлуоресцирующими молекулами и обладающие высоким сродством друг к другу. Они легко присоединяются к антителам и многим флуорохромам. Чаще всего биотин коньюгируют с антителами, а авидин – с флуорохромами. При проведении реакции непрямой иммунофлюоресценции клетки сначала инкубируют с биотилированными антителами, а затем с коньюгатом флуорохром-авидин.