Основные принципы и диагностические возможности проточной цитометрии в клинической иммунологии и эндокринологии, страница 2

·  детекции и мониторирования минимальной резидуальной болезни (MRD).

Диагностические возможности  проточной цитометрии

А. Использование проточной цитометрии для количественной оценки                            популяций                   и  субпопуляций лимфоцитов

Открытие  в 1975 г. гибридомной технологии получения МКА предоставило возможность изучить иммунологические маркеры клеток, охарактеризовать их фенотип по набору поверхностных антигенов и рецепторов, строго специфичных для определенной клеточной линии. В 1982 г. в Париже проведено I  Рабочее совещание по созданию единой номенклатуры МКА, на котором МКА со сходной специфичностью были объединены в группы (кластеры). Первоначальное значение понятия «кластер дифференцировки»  (CD) подразумевал набор МКА, распознающих одну и ту же антигенную структуру на поверхности клеток. Со временем термин “кластер дифференцировки” стал означать саму структуру на клеточной поверхности. В настоящее время с помощью МКА  идентифицировано около 166 поверхностных антигенов лейкоцитов [см. приложение N 19].  В большинстве случаев определена их молекулярная масса, химическая структура, функция [1, 9, 12].

            Проточная цитометрия является одним из наиболее высокочувствительных и объективных методов определения дифференцировочных антигенов лейкоцитов. Она позволяет проводить быстрый популяционный  и субпопуляционный анализ клеток крови по всем известным в настоящее время CD-маркерам при наличии соответствующей панели моноклональных антител.

В основе работы проточного цитометра лежит одновременное разделение лейкоцитов на  три популяции – лимфоциты, моноциты и гранулоциты – на основании измерения сигналов светорассеивания под малым (1-10⁰) и большим  углами, и измерение интенсивности флюоресценции   изучаемых клеток, меченных специфическими МКА.

Рис. 2.  Распределение на три популяции. (внизу – лимфоциты,  в средней части графика – моноциты, вверху – нейтрофилы).

Как, уже говорилось выше, сигналы светорассеяния, характеризующие размер клетки (FSC), а также цитоплазматические и мембранные особенности (SSC) привязывают флюоресцентный анализ к морфологически определенным популяциям. В соответствии с этим ( рис. 2) лимфоциты, имеющие небольшие сигналы переднего и бокового светорассеивания располагаются в нижней части графика, моноциты несколько выше правее, так как для них характерны средние значения этих показателей,  нейтрофилы, в свою очередь, располагаются в верхней части графика, так для них характерны высокие сигналы вышеназванных показателей.

Субпопуляционный анализ лимфоцитов может быть проведен с помощью МКА, меченных различными флуорохромами. В связи с этим необходимо осветить ряд вопросов, связанных с выбором флуорохромов и процедурой окрашивания  суспензии исследуемых клеток МКА.

                          Выбор флуорохрома и процедура окрашивания

Выбор флуорохрома зависит от многих факторов, в частности от того, какой флуорохром способен регистрировать имеющийся проточный цитометр. Идеальный флуорохром  должен обладать следующими свойствами:

·  - возбуждаться при нужной длине волны;

·  - легко связываться с белками;

·  - обладать низким уровнем неспецифического связывания (окрашивания);

·  - его излучение должно лежать в диапазоне максимальной чувствительности фотодетектора;

·  - длины волн излучаемого при его флюоресценции света не должны совпадать с длинами волн «аутофлюоресценции» (флюоресценция молекул, присутствующих в анализируемых клетках, но не имеющих отношения к флуорохрому);

·  - должна существовать возможность использования данного флуорохрома одновременно с другими флуорохромами в одном опыте.

Таким образом, идеальный флуорохром должен быть удобен при использовании, давать легко детектируемый  и отличный от фона сигнал и позволять применение одновременно с ним других флуорохромов.