Аннотация 2
1 Введение 3
2 Эксперимент
2.1 Описание установки 3
2.2 Методика измерений 5
3 Результаты 6
4 Выводы 9
5 Литература 10
Аннотация. Данная работа посвящается изучению явления светорассеяния и флюоресценции от одиночных биологических частиц с помощью сканирующего проточного цитометра. Были получены индикатрисы (зависимости интенсивности от угла рассеяния лазерного света) рассеянного света, а также были померены интенсивности флюоресцирующего света как от самого красителя ФИТЦ, так и от флуоресцентных латексов. Качественно исследован разброс флуоресцентных латексов по интенсивности флуоресценции, а также выявлены возможные причины, приводящие к данному разбросу. Было статистически для 300 латексов определено среднее количество молекул красителя на латексе, для проверки были оценены верхняя и нижняя границы числа молекул красителя на латексе.
В настоящее время для многих научных исследований в биологии и медицине применяется проточный цитометр. Метод проточной цитометрии отличается быстродействием по сравнению с микроскопом и позволяет разрешать ~300 частиц в секунду размером порядка микрона. Сканирующая проточная цитометрия позволяет получать индикатрисы светорассеяния по углам от каждой пролетающей частицы. Это позволяет точно идентифицировать частицы.
Многие задачи в медицине и биологии решаются с помощью иммунофлуоресцентных методов [4]. Этот метод используется для изучения различных взаимодействий, например, антиген-антитело. Он состоит в том, что один из элементов, участвующих в изучаемом взаимодействии, например, антиген, помечается флуоресцентным маркером, т.е. красителем. После этого можно судить о количестве связавшегося антигена по интенсивности флуоресценции. Подобные измерения можно осуществить на сканирующем проточном цитометре, добавив ко всем преимуществам иммунофлуоресцентных методов ещё и очень высокое быстродействие. При этом для калибровки таких измерений используются флуоресцентные латексные частицы диаметром несколько микрометров, на поверхность которых нанесён краситель. Для проведения количественных измерений важно знать сколько молекул красителя находится на поверхности.
Умение определять количество молекул красителя на биологических клетках может быть использовано при изучении кинетики взаимодействия антиген-антитело, при проникновения вируса в клетку, а также для разделения схожих классов клеток по их рецепторному связыванию, примером этого могут служить T- и B-лейкоциты. Определение свойств функционирования рецепторов является недостающим звеном для определения функций клеток, что в медицине может быть использование для создания новых лекарственных препаратов.
Целью данной работы являлось:
1. Освоение метода сканирующей проточной цитометрии на примере сканирующего проточного цитометра с флуоресцентным каналом.
2. Одновременное измерение светорассеяния и флуоресценции от одиночной частицы – латекса в красителе и без ( в дистиллированной воде).
3. Определение количества молекул красителя ФИТЦ (флуоресцеина изотиацианат) на поверхности флуоресцентных латексов диаметром 2мкм.
Основная идея проточных цитометров заключается в измерении характеристик одиночных частиц. Для этого с помощью гидрофокусирующей головки создается два ламинарных коаксиальных потока - внутренний (с диаметром порядка 10-30 мкм), представляющий собой пробу с измеряемыми объектами, и внешний, состоящий из дистиллированной и отфильтрованной воды. За счет малого сечения внутренней струи и ламинарности потока в рабочей зоне прибора создается возможность измерения характеристик одиночной частицы. При этом максимальная скорость измерений на проточных цитометрах достигает сотен тысяч частиц в минуту. Такие измерения свойств одиночных частиц, не требующие каких либо предположений о характере распределения, позволяют легко отслеживать малые изменения во всей системе. С другой стороны, высокая скорость накопления данных позволяет измерять большое количество частиц, что дает высокую статистическую достоверность результатов.
Основным отличием сканирующего проточного цитометра (рис. 1) от проточного цитометра стандартной конфигурации является наличие сканирующей оптической кюветы, в которой свет, рассеянный одиночной частицей, сканируется по апертуре фотоприемника во время ее движения в потоке по капилляру кюветы. Основное излучение (Ar лазер, 488нм, 10мВт, лазер1 на рис.1) распространяется вдоль оси канала, по которому движутся частицы, и фокусируется в кювету через оптическое окно в нижней части сканирующей оптической кюветы. Фокусировка луча (линза1 на рис.1) обеспечивает постоянную освещенность движущейся частицы во время измерения.
Для любой точки на оси потока внутри рабочей зоны существует определенный угол рассеяния q, для которого рассеянный частицей свет отразится сферическим зеркалом (радиус 4.43 мм) параллельно оси потока. Далее этот световой цилиндр, покинув оптическую кювету, отражается от поверхности зеркала1, и фокусируется линзой2 (фокусное расстояние 300 мм) на диафрагме (диаметр 500 мкм), расположенной на входном окне фотоумножителя (ФЭУ1).
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.
