Таким образом, в каждый момент времени на ФЭУ попадает свет, рассеянный частицей под определенным углом q. Сигнал с ФЭУ непрерывно поступает на вход АЦП связанного с ЭВМ. Частица при выходе из рабочей зоны пересекает луч триггерного лазера (лазерная указка, лазер2 на рис. 1). Сигнал от рассеяния частицей света вперед, регистрирующийся с помощью фотодиода, позволяет определить положение частицы на оси канала в определенный момент времени.
|
Рис. 1. Схема сканирующего проточного цитометра, модифицированного для флюоресцентных измерений. |
Однозначная связь местоположения частицы и угла рассеяния света, для которого свет попадет на ФЭУ, позволяет восстановить зависимость интенсивности рассеянного света от угла рассеяния. Такая зависимость называется индикатрисой светорассеяния. Индикатриса светорассеяния определяется морфологическими свойствами частицы. Она сильно зависит от формы, размеров, показателя преломления и т.д. Обратная задача светорассеяния решается, позволяя получить по индикатрисе размер и показатель преломления частицы. Таким образом, исследование индикатрис является мощным средством анализа параметров частиц.
В данной работе использовался модифицированный сканирующий проточный цитометр. Главное отличие от основного варианта состоит в добавлении лазера 3 (импульсный N2 лазер, 337нм, рис. 1) и объектива 1 с фотоумножителем (ФЭУ2). Данные изменения позволяют одновременно с индикатрисой светорассеяния от одиночной частицы измерять от нее же сигнал флюоресценции. Частица при движении в потоке по капилляру оптической кюветы после триггерного луча пересекает луч азотного лазера, возбуждающего флюоресценцию в молекулах красителя. Сигнал флюоресценции регистрируется ФЭУ под углами в 90° к возбуждающему лучу азотного лазера и к лучу индикатрисного лазера. Для того, чтобы обеспечить попадание в ФЭУ только сигнала флуоресценции, применяется два фильтра: оранжевый и интерференционный с максимумом пропускания 525нм. Сигнал с ФЭУ поступает на другой канал АЦП. Таким образом, результатами измерения одной частицы являются сигнал светорассеяния и сигнал флюоресценции. При этом флуоресценцию можно возбуждать как флуоресцентным (в данной установке – N2 лазер) так и индикатрисным (в данной установке – Ar лазер) лазером.
Характерный вид экспериментального сигнала приведен на рис. 2.
|
Рис. 2. Экспериментальный сигнал от одиночной частицы (флуоресцентного латекса). |
Эксперимент проводился в 4 этапа.
На первом этапе проверялось отсутствие сигнала в флуоресцентном канале, связанного со светорассеянием. Для этого снимались индикатрисы светорассеяния и сигнал флуоресценции от раствора 3мкм-латексов (нефлуоресцентных) в воде.
На втором этапе строилось распределение флуоресцентных латексов по интенсивности флуоресценции и размерам, чтобы определить разброс по интенсивности флуоресценции и причины его вызывающие. Для этого исследовался раствор флуоресцентных латексов в воде.
Дальше использовался раствор ФИТЦа с концентрацией 10-3г/см3. В этот раствор добавлялись флуоресцентные латексы, которые требовалось прокалибровать, а также латексы диаметром 3мкм без молекул красителя на поверхности.
На третьем этапе задержка импульсного азотного лазера по отношению к триггеру выбиралась таким образом, чтобы он «выстреливал» в тот момент, когда латекс проходит то место, где луч лазера пересекает канал. Таким образом, мы получали флуоресцентный сигнал от флуоресцентных латексов + окружающий раствор красителя, и 3мкм-латексы + окружающий раствор красителя, в зависимости от того на какой из латексов сработал триггер.
На последнем этапе задержка импульсного азотного лазера увеличивалась так, чтобы он заведомо не попадал по латексам. В этом случае, мы получали флуоресцентный сигнал только от раствора красителя.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.
