Явление светорассеяния и флюоресценции от одиночных биологических частиц с помощью сканирующего проточного цитометра, страница 3

Построив распределение по интенсивности флуоресценции, мы получили кривую с двумя максимумами на третьем этапе и с одним – на четвёртом. Разница между двумя максимумами на 3-ем этапе (I_л – 3мкм-латексы, и I_ф – флуоресцентные латексы) обуславливается дополнительной флуоресценцией молекул ФИТЦа на поверхности флуоресцентного латекса (N молекул). Разница между максимумом на 4-ом этапе (I_к – один краситель) и I_л обуславливается тем, что нефлуоресцирующий 3мкм-латекс вытесняет своим объёмом раствор красителя и уменьшает флуоресценцию. Обозначим диаметр этого латекса d_л, его объём ; диаметр флуоресцентного латекса d_ф, его объём ; объём флуоресцирующего раствора красителя в отсутствии латекса V, концентрация красителя в растворе (молекул на единицу объёма) C. Используя введённые обозначения можно написать:

,                                                                                                                                                 (1)

из первого равенства в (1), из второго равенства в (1)                                                                                                                                                  (2)

По этой формуле и считается искомое значение для N.

3  Результаты

На первом этапе был получен сигнал, равный сумме сигналов светорассеяния и флуоресценции, от 3мкм-латексов. Он представлен на рис.3. На нём хорошо видно, что сигнал флуоресценции от 3мкм-латексов находится на уровне шума, что подтверждает то, что сквозь фильтры проходит только действительно флуоресценция, это позволяет оправдать предложенный способ калибровки флуоресцентных латексов.

Результаты второго этапа приведены в виде распределения флуоресцентных латексов по интенсивности флуоресценции (рис.4) и диаграммы интенсивность флуоресценции – размер (рис.5). На рис.4 виден разброс флуоресцентных латексов по интенсивности флуоресценции. Возникает вопрос: с чем это связано? Одно из возможных объяснений состоит в том, что в связи с разными размерами, флуоресцентные латексы имеют разное количество молекул ФИТЦа на поверхности. Однако, рис.5 показывает, что эти две величины являются статистически независимыми. Тем не менее, разброс по количеству молекул красителя на поверхности флуоресцентных латексов может быть, но он не связан с их размером.

Другой причиной является непостоянство мощности импульса лазера, которое имеет значение в случае ненасыщения лазером флуоресценции. В нашем случае ненасыщение, видимо, имеет место, что даёт вклад в разброс по интенсивности флуоресценции.

На третьем этапе было получено распределение по интенсивности флуоресценции. Эта кривая имела два чётких максимума вблизи 145 и 225 условных единиц. При изменении задержки импульсного азотного лазера на непопадание (4-ый этап) по латексам получилось распределение с одним максимумом вблизи 160 относительных единиц. Однако при изменении задержки лазера обратно, распределение опять имело два максимума, но первый из них был уже в районе 170 относительных единиц.

Изменение кривых распределения по интенсивности флуоресценции, очевидно, имело место и связано с ростом диаметра струи со временем. В результате увеличения диаметра происходило увеличение объёма флуоресцирующего красителя и, следовательно, увеличение сигнала флуоресценции от раствора красителя. Поэтому происходил сдвиг максимумов кривых распределения по интенсивности флуоресценции в сторону увеличения интенсивности.

Результаты третьего и четвёртого этапа (статистика – 300 частиц на каждом этапе) сведены в таблицу: