Явление светорассеяния и флюоресценции от одиночных биологических частиц с помощью сканирующего проточного цитометра, страница 4

Сдвиг не удалось устранить, что существенно снизило точность определения искомого количества молекул ФИТЦа на флуоресцентном латексе. Тем не менее, можно рассчитать оценку снизу для концентрации, это делается следующим образом:

Значения I_л и I_ф можно считать точно определёнными и равными 145 и 225 относительных единиц соответственно, а значение I_к известно лишь в более поздний момент времени. В тот момент времени, когда измерялось I_л и I_ф, значение I_к было меньше, однако, очевидно, что I_к>I_л. Поэтому получаем 145<I_к<160. N(I_к) (см. (2)) является, очевидно, убывающей функцией при I_к>I_л, следовательно, для N получаются следующие пределы:

N(160)<N<N(145),

N(145)=¥, посчитаем N(160). Молярная масса молекулы ФИТЦа равна М=389 (число Авогадро N_A=6×10²³), отсюда (d_л=3мкм, d_ф=2мкм):

,

,

Получаем из (2):

,

Можно также получить ограничение сверху для числа N из простых физических соображений. Предположим, что весь объём флуоресцентного латекса заполнен красителем, и оценим плотность чистого красителя сверху как r=1г/см³ (плотность ароматических соединений меньше чем воды). Тогда .

В результате получаем 10⁸<N<6×10⁹.

Обсудим теперь как получить точный результат для N, и какие ещё есть способы измерения N. Для получения точного результата в рамках используемого метода, необходимо либо устранить изменение параметров струи со временем, или как-то учесть их, например, предположить постоянную скорость сдвига максимумов кривой распределения по интенсивности флуоресценции и проводить измерение не только положения интенсивностей, но и соответствующих моментов времени. В связи с этим есть, однако, проблема, связанная с тем, что изменение параметров струи приводит не только к сдвигу максимумов кривой распределения, но и их уширение со временем (это происходит из-за того, что суммируются кривые со сдвинутыми относительно друг друга максимумами). Это ограничивает набор статистики и, следовательно, не позволяет достичь большой точности.

Один из других способов определения N состоит в том, чтобы определять V не из отношения интенсивностей флуоресценции с 3мкм-латексом и без него, а непосредственно. Это можно сделать, если предположить, что объём V представляет собой цилиндр с диаметром равным диаметру струи и длиной равной l=v×t, где v – скорость струи, определяемая с помощью анализа индикатрисы светорассеяния на 3мкм-латексах, t – время пролёта латексом зоны флуоресценции, которое можно определить по длительности сигнала флуоресценции от непрерывного аргонового лазера. Для определения диаметра струи можно измерять расход пробы, например, по весу. Однако, для этого необходимы достаточно длительные измерения порядка 1 часа. При этом изменение толщины струи по времени сильно понизит точность измерения.

4  Выводы

·  Освоен сканирующий проточный цитометр.

·  Одновременно измерены светорассеяние и флуоресценция от одиночных частиц.

·  Получен и обсуждён разброс флуоресцентных латексов по интенсивности.

·  Получена экспериментальная оценка снизу и теоретическая оценка сверху для количества молекул ФИТЦа на поверхности флуоресцентного латекса. В результате 10⁸<N<6×10⁹.

·  Обсуждены проблемы использованного метода и возможные другие методы определения искомой величины.

5  Литература

1.  Дж. Стейнкамп. Цитометрия в потоке. Приборы для научных исследований. Мир, М., N9, 1984.

2.  Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, New York, 1991.

3.  J.T. Soini, A.V. Chernyshev, P.E. Hanninen, E. Soini, and V.P.Maltsev. Cytometry. Vol. 31, No. 2, p. 78-84, 1998.

4.  Иммунологические методы. Под редИ.Я. Фримеля. М., 1987.

5.  Ю.И.Наберухин. Лекции по молекулярной спектроскопии.