Тетрадь для лабораторных работ по спецкурсу "Экспериментальная иммунология", страница 8

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7

дата

Серологический метод: реакция агглютинации. Механизм взаимодействия антиген-антитело, его реализация в виде феномена агглютинации. Компоненты реакции, их подготовка. Регистрация результатов. Области применения

Методический материал

Реакция агглютинации (РА) представляет собой один из способов выявления антигена/антител по принципу нахождения известного по неизвестному. В случае нерастворимости антигена (его корпускулярности) при добавлении к нему специфичных антител происходит формирование комплекса "антиген-антитело" в виде белкового агломерата. Этот феномен получил название агглютинации. Основное преимущество реакции агглютинации - возможность визуального учета и простота постановки. С другой стороны в сравнении с более современными способами выявления антиген/антитела чувствительность реакции агглютинации невысока. 

Существуют различные варианты РА: 1) пробирочные и на стекле,

                                                                2) объемные и капельные,

                                                                3) количественные и качественные,

                                                                4) обычные, ускоренные и экспресс-реакции

Основные области применения РА связаны с необходимостью индентификации микробных культур, антигенов клеток крови (А,В,0), а также с определением наличия и титра антител или антигенов в сыворотке крови в практике инфекционных болезней.

Компоненты РА: 1) диагностический компонент - антиген в виде суспензии в случае поиска антител, т.е. диагностикум,  или раствор антител при необходимости идентификации антигена, т.е. диагностическая сыворотка. В случае РА чаще диагностикум называют агглютиногеном, а диагностическую сыворотку - агглютинином;

                             2) исследуемый материал - микробная культура в виде суспензии или выросшей на скошенном агаре, клетки крови (эритроциты при определении антигенов по системе А,В,0), сыворотка крови пациента при диагностике инфекционного заболевания или сыворотка крови лабораторного животного при постановке биологического/иммунологического эксперимента;

                             3) раствор электролита в качестве среды для разведения ингредиентов реакции и в качестве среды для постановки реакции. Обычно используют 0,15 М (0,85%) раствор хлорида натрия, реже - другие прописи.

Лабораторная посуда и необходимое оборудование. Как правило для постановки РА необходим ограниченный перечень оборудования: 1) пробирки или предметные стекла для самой реакции (иногда нужны особые блюдца или другие предметы, например, для определения группы крови), 2) пипетки стеклянные или автоматические дозаторы с наконечниками, 3) термостат или холодильник, т.к. разные варианты РА проводятся при разных температурных режимах, 3) источник света и черная поверхность для лучшей визуализации результата РА.

Схема постановки РА: 1) приготовление разведений исследуемого образца, 2) внесение разведений в пробирки или нанесение их на стекло, 3) добавление диагностического компонента, 4) инкубация при необходимых температурных условиях, 5) регистрация результатов.

Регистрация результатов РА проводится по системе 4+ в процессе визуального осмотра. Так как в любом варианте РА антиген (искомый или диагностикум) представляет собой суспензию частиц (корпускул), то при отсутствии специфичности с антителами не происходит их связывания и образования осадка. Поэтому отрицательный результат РА визуально неотличим от контроля диагностикума (или искомого антигена): жидкость равномерно мутная или с выраженной опалесценцией. Сомнительный результат, оцениваемый как +, представляет собой мутную взвесь с наличием маловыраженных хлопьев. Слабо положительный результат, выражаемый  ++, означает наличие специфичности между антигеном и антителами и связывание 50 % имеющегося в системе антигена. При этом в пробирке (или на стекле, в зависимости от варианта методики постановки РА) наблюдается образование четкого хлопьевидного (или зернистого) осадка, но в то же время сохраняется существенная мутность раствора. Положительная РА, выражаемая в виде +++, означает связывание 75 % антигена. В этом случае на дне пробирки определяется отлично заметный плотный осадок, а вокруг него - легкая опалесценция жидкости. Резко положительная РА - ++++ - наблюдается при 100 % связывании антигена: определяется хлопьевидный осадок, при длительной инкубации принимающий вид перевернутого парашюта ("зонтика"), а жидкость вокруг осадка абсолютно прозрачна.

Задание

Протокол

1. Поставьте качественную реакцию агглютинации на стекле из предложенных реактивов. Зарисуйте механизм РА, схему постановки и результат. Сделайте выводы

2. Поставьте количественный вариант реакции агглютинации, определите титр антител. Зарисуйте механизма РА, схему постановки и результат

3. Определите нарастание титра антител в реакции агглютинации. Сделайте вывод об этиологическом значении нарастания титра