Тетрадь для лабораторных работ по спецкурсу "Экспериментальная иммунология", страница 5

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4

дата

Регистрация развития клеточного иммунного ответа: развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)

Методический материал

Реакция ГЗТ характеризуется 2 важными чертами: информативностью и простотой воспроизведения, вследствие чего ГЗТ широко используется для решения прикладных задач экспериментальной иммунологии.

При постановке ГЗТ антиген вводят животному двукратно - для сенсибилизации (индукция иммунного ответа) и для разрешения ГЗТ. Через 5-7- суток после первой иммунизации (внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной) животному вводят разрешающую дозу антигена, а еще через 2 суток проводят учет реакции ГЗТ, определяя индекс реакции ГЗТ. Таким образом на изучение клеточного иммунного ответа в эксперименте затрачивается около 7 - 10 суток.

Сенсибилизация корпускулярным или растворимым белковым антигеном вызывает образование антигенспецифических Т-лимфоцитов. При повторном введении антигена эти Т-лимфоциты специфически взаимодействуют с ним и выделяют ряд провоспалительных цитокинов. Если разрешающая доза антигена вводится подкожно или внутрикожно, то на месте инъекции развивается воспалительная реакция интенсивность которой легко измерить. Иногда производят гистологическое или иммуногистологическое исследование инфильтрата, позволяющее оценить структурно-функциональные особенности иммунокомпетентных клеток в зоне развития ГЗТ.

Наиболее удобной моделью для воспроизведения реакции ГЗТ у мелких животных (мышей) является плантарная. Эта модель  предполагает введение разрешающей дозы антигена под апоневроз задней лапки. В месте введения разрешающей дозы антигена развивается реакция ГЗТ.

Учет реакции  ГЗТ проводят, измеряя выраженность инфильтрата. Это делают различными способами:

1) отсекают обе лапки - контрольную и опытную, на одном уровне и проводят взвешивание;

2)  опускают поочередно каждую лапку в мерный цилиндр с водой, отмечая при этом количество вытесняемой жидкости (плетизмография);

3)  проводят измерение объема лапок с помощью микрометра.

В любом случае выраженность реакции ГЗТ оценивают количественно в виде индекса реакции: ИР = ((опыт- контроль)/контроль)´100 % или ИР = опыт/контроль

Задания

Протокол

1. Введите в правую лапу (под апоневроз) мыши разрешающую дозу антигена - 20 мкл суспензии эритроцитов барана в концентрации  1´10⁸ клеток/мл. В контрлатеральную лапу введите такой же объем физраствора (контроль).

2. Через 24 и 48 часов измерьте объем обеих лап и определите индекс реакции ГЗТ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 5

дата

Регистрация развития гуморального иммунного ответа в эксперименте: определение массы органов иммунной системы, определение весовых индексов, определение антителообразующих клеток селезенки по Ерне (реакция локального гемолиза), определение уровня и классовой принадлежности антител в реакциях агглютинации

Методический материал

При регистрации выраженности гуморального иммунного ответа исследуют:

*   весовые индексы органов иммунной системы, у мышей - преимущественно селезенки,

*   клеточность органов иммунной системы,

*   функциональные параметры иммуноцитов (ответ на В-зависимые лектины, митогены, антигены, иммунологический фенотип,

*   способность иммуноцитов продуцировать антитела, т.е. количество антителообразующих клеток и уровень специфических антител

Для мониторинга развития гуморального иммунного ответа обязательно сравнение указанных параметров у животных опытной и контрольной групп.

Постановка реакции определения антителообразующих клеток по методу Ерне (реакция локального гемолиза)

Если иммунизация мышей проводилась эритроцитами барана, то ход реакции заключается в следующем. В предварительно подготовленные камеры Каннингама вносят 0,15 мл смеси, состоящую из

0,3 мл 20 % суспензии эритроцитов барана +

0,1 мл свежего комплемента +

0,5 мл среды 199 +

0,4 мл суспензии спленоцитов в концентрации 1´10⁷ клеток/мл.

Камеру герметизируют парафином, инкубируют 1 час в термостате. После инкубации считают число зон гемолиза, соответствующих расположению антителообразующих клеток.

Для определения классовой принадлежности антител учитывают динамику развития гуморального иммунного ответа. Для определения уровня антител-IgM мышей забивают на 4-е сутки после иммунизации (пик уровня IgM). Для определения антител-IgG животных снимают с опыта на 6-7 сутки после иммунизации (пик уровня IgG). Чтобы определить число АОК- IgG ставят реакцию по описанной выше схеме, а затем дополнительно вносят в реакционную смесь кроличью антисыворотку против мышиного IgG, затем - комплемент и дополнительно просчитывают вновь появившиеся зоны гемолиза, каждая из которых соответствует одной АОК- IgG.

Если животные иммунизированы иным антигеном, то проводят пассивную реакцию - суспензию бараньих эритроцитов, предназначенных для постановки реакции локального гемолиза, сенсибилизируют антигеном, использованным для иммунизации. Все остальные ингредиенты и ход реакции в целом аналогичны указанным выше.

Уровень антител определяют с помощью серологических реакций или с помощью иммунохимического метода, в частности ИФА с использованием коммерческих тест-систем. Исследуемым материалом является периферическая кровь. У крупных животных порцию крови получают при пункции крупных вен или сердца, у мелких (мышей) - при декапитации, реже - из ретроорбитального синуса.

Кровь собирают в сухую, желательно стерильную пробирку, которую инкубируют до формирования сгустка, сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки, пробирку центрифугируют для отделения сыворотки крови. Сыворотку крови отбирают в микропробирку и хранят до исследования в замороженном виде.

Если уровень антител определяется в серологических реакциях с использованием эритроцитов (реакция гемагглютинации), то тестируемые образцы необходимо прогреть на водяной бане при +56  °С в течение 30-40 минут для инактивации комплемента.

Наиболее простой реакцией для определения уровня антител в сыворотке крови в случае иммугизации животных эритроцитами барана является реакция гемагглютинации. Если иммунизация проводилась иными антигенами - используют реакцию пассивной гемагглютинации с предварительной сенсибилизацией суспензии эритроцитов антигеном.

Постановка реакции гемагглютинации