Тетрадь для лабораторных работ по спецкурсу "Экспериментальная иммунология", страница 4

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2

                              дата

Правила снятия животных с эксперимента. Методы получения органов иммунной системы. Приготовление клеточных суспензий. Определение клеточности/ жизнеспособности клеток

Методический материал

*  Методы эвтаназии животных зависят как от вида используемых в эксперименте животных, так и от целей эксперимента. При проведении иммунологических экспериментов наиболее часто используют 1) декапитацию (при необходимости получения максимально возможного количества крови), 2) цервикальную дислокацию и 3) эфирный (хлороформный) наркоз в летальной дозе.

*  После эвтаназии животного (мыши), его фиксируют на парафиновом столике, обрабатывают антисептиком кожу и рассекают от хвоста до грудины. При необходимости исследования тимуса, разрез продлевают и на грудную клетку. После фиксации кожи, проводят выделение регионарных лимфоузлов, тимуса, селезенки. Выделенные органы взвешивают на торсионных весах, отмечая в журнале массу органов. (При необходимости из органов готовят гистологические препараты или мазки-отпечатки, которые можно исследовать цитохимическими, иммуноцитохимическими, гистохимическими или иммуногистохимическими методами.) Затем органы переносят в чашки Петри с раствором Хенкса или средой 199 и проводят диспергирование. Данную процедуру можно проводить 3 способами:

1)  орган разрезается бритвенным лезвием на несколько частей а затем расщипывается с помощью глазных пинцетов. Суспензия клеток пропускается через капроновую ткань и дополнительно отстаивается для удаления крупных конгломератов;

2)  орган продавливается через стальную сетку, после чего смывают солевым раствором гомогенат. Дальнейшие процедуры проводятся аналогично п.1;

3)  орган гомогенизируют в гомогенизаторе, этот метод приводит к разрушению значительного числа клеток, поэтому его применяют чаще для биохимических исследований и для получения субклеточных структур;

4)  орган разделяют на небольшие фрагменты (1 мм³) и подвергают обработке ферментами. Количество и набор ферментов различен в зависимости от того, из какого органа и в каких условиях требуется получить суспензию клеток. Чаще всего используют смесь трипсина и EDTA в солевом буферном растворе или питательной среде (метод трипсинизации). При выделении клеток из тканей старых животных, животных, подвергнутых действию ионизирующего излучения, в смесь ферментов добавляют коллагеназу и др. ферменты. Лучше всего клетки выделяются из ткани молодых животных, что связано с особенностями развития соединительной ткани.

*   Если суспензия клеток загрязнена эритроцитами, попавшими в нее из мелких и крупных сосудов при диспергировании органа, то суспензию подвергают процедуре элиминации эритроцитов. Для этого к осадку клеточной суспензии добавляют 0,1-0,25 мл дистиллированной воды (метод гипотонического шока), содержимое пробирки встряхивают, оценивая на глаз степень гемолиза (обычно 5 -15 секунд), затем добавляют солевой буферный раствор для восстановления изотоничности среды, клеточную суспензию отмывают буферным солевым раствором  Далее приготовленная клеточная суспензия используется для проведения иммунологических и др.реакций. Более мягкая процедура связана с использованием 0, 84 % раствора NH₄Cl: к осадку клеток добавляют до 1-5 мл (в зависимости от количества клеточной суспензии и эритроцитов) раствора NH₄Cl, инкубируют при комнатной температуре до 15-25 минут, периодически оценивая визуально степень гемолиза, затем клеточную суспензию подвергают процедуре отмывая.

*   Полученная суспензия клеток отмывается буферным солевым раствором или питательной средой, после этого определяется жизнеспособность клеток и концентрация клеточной суспензии.

*   Процедура отмывания заключается в следующем: 1) диспергированная суспензия клеток в объеме 2-10 мл седиментируется путем центрифугирования при режиме 1-3 тыс. оборотов/мин 5-15 мин, супернатант выливается, а к осадку клеток добавляется 5-10 мл буферного солевого раствора или питательной среды, 2) осадок клеток тщательно ресуспендируется в  порции солевого раствора или питательной среды, при этом нельзя допускать образования пузырей или вспенивания жидкости, так как эти явления оказывают повреждающее клетки действие, 3) клеточная суспензия опять подвергается центрифугированию при аналогичных режимах. Этот цикл отмывания клеток может быть повторен до 3 раз, что позволяет очистить клеточную суспензию от примеси разрушенных клеток и белковых компонентов.

*   Следует учитывать, что процедура отмыванию может выполняться в различных режимах, что связано с особенностями отмываемых клеток. Данная информация, как правило, представлена в специальных руководствах и протоколах по проведению иммунологических и клеточных методов, разработанных фирмами-производителями реактивов.

*   После выделения клеток оценивают качество клеточной суспензии: 1) определяют жизнеспособность клеток и 2) определяют концентрацию клеток.

*  Жизнеспособность клеток проверяют микроскопически с помощью окрашивания. Для этого в равных объемах смешивают клеточную суспензию и раствор красителя, каплю смеси помещают на предметное стекло и накрывают покровным, либо пользуются камерой Горяева (гемоцитометром). На увеличении 40´ подсчитывают количество окрашенных/неокрашенных клеток суспензии, определяя затем процент жизнеспособности. Обычно, просчитывают не менее 100 клеток, число окрашенных/неокрашенных клеток, таким образом, непосредственно обозначает процент жизнеспособности клеточной суспензии.

*   Красители для определения жизнеспособности делятся на 2 основные группы: 1-ая - красители, проникающие через цитоплазматическую мембрану погибших клеток и окрашивающие, соответственно цитоплазму мертвых клеток, - трипановый синий, эритрозин В, метиленовый синий и др.; 2—я  - витальные красители, проникающие только в живые клетки вследствие пиноцитоза или иных способов транспорта - нейтральный красный. Витальные красители окрашивают только живые клетки. В настоящее время получены и флуоресцентные красители для оценки жизнеспособности клеток, причем учет результатов проводится как с помощью люминесцентного микроскопа, так и с помощью проточного цитофлуориметра. 

*  Концентрацию клеточной суспензии оценивают стандартным методом с помощью гемоцитометра: клеточную суспензию разводят в 200 или менее раз в 3 % уксусной кислоте или буферном растворе, заполняют гемоцитометр и подсчитывают количество клеток во всех больших квадратах. Полученное значение умножают на 50 и получают концентрацию клеток в мкл.

*  Получение  костного мозга.  После вскрытия животного, извлекают трубчатые кости, чаще всего - бедренные. Чтобы вскрыть полость бедренной кости, от нее отрезают головки. Проводят пункцию кости с обоих концов инъекционными иглами. В место среза кости вкалывают иглу, надетую на 5-миллилитровый шприц. Каждый раз используют чистую иглу. Для вытеснения костного мозга в полость кости под давлением вводят при помощи шприца около 1 мл среды. Полученную клеточную суспензию обрабатывают аналогично суспензиям, полученным из других органов.

Задания

Протокол

1. Проведите декапитацию, соберите кровь, используйте ее для определения концентрации лейкоцитов, приготовьте мазок крови, зафиксируйте его и окрасьте по Романовскому-Гимзе. Определите лейкоцитарную формулу, зарисуйте основные популяции лейкоцитов

2. Проведите вскрытие мыши

3. Извлеките органы иммунной системы, взвесьте их, определите весовые индексы

4. Приготовьте мазки-отпечатки из органов иммунной системы, зафиксируйте, окрасьте по Романовскому-Гимзе, зарисуйте морфологию органов

5. Приготовьте суспензию спленоцитов, определите ее концентрацию и жизнеспособность клеток

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 3

дата

Изучение функциональной активности перитонеальных макрофагов мыши (фагоцитоза): выделение перитонеальных макрофагов, подготовка объектов фагоцитоза, постановка реакции. Методы регистрации фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов

Методический материал

Макрофаги, представляющих собой основную популяцию антигенпрезентирующих клеток, являются важным объектом для проведения иммунологических экспериментов. Поскольку тканевые макрофаги   имеют отростки, то выделение этих субпопуляций клеток сопряжено с массой технических сложностей. В настоящее время разработаны специальные протоколы выделения макрофагов печени (клеток Купфера) и других популяций. Причем все процедуры выделения аналогичны описанным в материале к лабораторной работе 2. Более доступны для исследовательских целей перитонеальные макрофаги, локализованные на поверхности брюшины. Количество перитонеальных макрофагов интактных животных невелико, эти клетки обладают высокой адгезивностью и низкой функциональной активностью. Перечисленные свойства перитонеальных макрофагов изменяются в значительной степени после действия стимулирующих факторов физико-химической или биологической природы (бактерии или их  компоненты).

Выделение перитонеальных макрофагов ориентировано на 2 основные возможности:

1) клетки  от интактного животного - их выход чрезвычайно низок, но такие клетки необходимы для оценки стимулирующего иммунный ответ или фагоцитоз воздействия исследуемых факторов. Популяция клеток из перитонеальной полости в данном случае гетерогенна, помимо макрофагов содержит эпителиальные и тучные клетки, причем соотношение этих популяций клеток определяется видом экспериментального животного. Если проведение эксперимента требует использования чистой популяции макрофагов, то полученную суспензию фракционируют, или очищают от примеси иных типов клеток;

2) привлеченные клетки, получаемые от животных, которым за 24-72 часа внутрибрюшинно вводили гидролизат казеина, тиогликолевую среду, пептон или другие стерильные субстанции  (1 - 2 мл на мышь или 2,5 - 3,0 мл на крысу) для индукции асептического воспаления. Вследствие динамики развития асептического воспаления через 1 сутки после введения активирующего агента в перитонеальной полости накапливаются нейтрофилы, а через 3-4 суток - макрофаги. Гомогенность (чистота) содержимого перитонеальной полости в данном случае высокая, но необходимо учитывать активированное состояние привлеченных макрофагов. Иногда для привлечения макрофагов в перитонеальную полость вводят паразитарную вакцину или компоненты бактериальных клеток.

Получение перитонеального смыва

·  Умерщвляют животное эфирным или хлороформным наркозом (цервикальная дислокация в данном случае недопустима). Мышь фиксируют в горизонтальном положении на спине с предельно разогнутыми конечностями. Обрабатывают кожу антисептиком.

·  Вводят в брюшную полость 3-4 мл 199 среды с 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. После легкого массажа приподнимают переднюю стенку живота, рассекают кожу и мышцы и через отверстие вводят тонкую полужесткую дренажную трубку, надетую на конус шприца. Отбирают жидкость из различных отделов брюшной полости. Промывание перитонельаной полости можно проводить несколько раз, объединяя все полученные порции смыва.

·  Затем, полученную суспензию отмывают 2-3 раза, определяют жизнеспособность клеток и проводят исследование их функциональной активности. В частности, определяют фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и их адгезивные свойства.

Исследование фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов

К суспензии макрофагов с концентрацией клеток 2 - 2,5´10⁶ /мл добавляется равный же объем суспензии бактерий (например, по 0,1 мл). В качестве объекта фагоцитоза используют 24-часовую культуру стафилококка или кандид, вакцинный штамм микобактерий или суспензию частиц латекса. Из культуры готовят 1 млн суспензию, ориентируясь на стандарт мутности соответствующего вида бактерий.

Пробы инкубируют 20 минут в термостате, центрифугируют при 1500 тыс.об/мин в течение 3-5- минут и клеточного осадка готовят мазки на предметных стеклах. После фиксации 15 мин в смеси Никифорова мазки красят по Романовскому-Гимзе (30 минут) и определяют фагоцитарный показатель и фагоцитарное число макрофагов:

  ФП= (число фагоцитов/число всех макрофагов)´100 %,

  ФЧ=число бактерий, фагоцитированных всеми просчитанными фагоцитами/число фагоцитов.

·  Существует еще один вариант реакции - фагоцитоз in vivo. Исследуемому животному вводят суспензию стафилококков (или др. объект) внутрибрюшинно, через 20-30 минут животное умерщвляют, вскрывают брюшную полость и готовят мазки-отпечатки с поверхности брюшины, препараты фиксируют, окрашивают и определяют фагоцитарные показатели.

Для исследования адгезивности макрофагов, суспензию этих клеток вносят по 2 мл в чашки Петри после предварительного определения числа клеток, инкубируют 1 час в термостате, сливают остаток суспензии, чашку промывают раствором трипсина и EDTA (раствор Версена) для снятия адгезировавшихся клеток и снова определяют их число в камере Горяева. Разность в числе клеток до внесения их в чашку и после инкубации позволяет определить процент клеток, обладающих адгезивными свойствами.

Задания

Протокол

1. Выделите суспензию перитонеальных клеток, приготовьте микроскопический препарата, зафиксируйте, окрасьте и определите клеточный состав

2. Осуществите постановку реакции фагоцитоза, определите фагоцитарные показатели, зарисуйте фагоцитирующие макрофаги