Практикум по физической химии. Лабораторные работы: Методическое пособие, страница 12

3.  Калий фосфорнокислый однозамещенный;

4.  Натр едкий, раствор;

5.  Калий иодистый;

6.  Раствор глюкозооксидазы (хранится в холодильнике).

НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ:

1.  Спектрофотометр SPECORD UV VIS или аналогичный;

2.  рН-метр;

3.  Автоматические микропипетки на 5 (10, 20) мкл.

Экспериментальная часть

Измерение скоростей ферментативной реакции проводят непосредственно в кювете спектрофотометра. Для этого в кювете смешивают приготовленные заранее реагенты (КI – реактив, раствор углевода, буфер), термостатируют до нужной температуры. Реакцию начинают добавлением аликвоты фермента, немедленно интенсивно перемешивают и записывают кинетическую кривую. Регистрация длится 1–5 мин в зависимости от количества добавленного фермента.

Каждый эксперимент воспроизводят 2–4 раза.

Приготовление растворов

Приготовление 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,0

·  Провести калибровку рН-метра по стандартному раствору с        рН = 6,86 при 25 ⁰С.

·  1,71 г калия фосфорнокислого однозамещенного растворить в диcтилированной воде в стакане объемом 200 мл. Довести рН полученного раствора до значения 6,0 на рН-метре с помощью раствора едкого натра. Перенести содержимое стакана в мерную колбу на 250 мл, довести до метки дистиллированной водой.

Приготовление КI - реактива

·  КI - реактив должен быть свежеприготовленным.

·  0.83 г калия йодистого растворить в 8 мл буферного раствора рН 6,0, добавить 2 мл 9%-ного раствора молибдата натрия, перемешать. Использовать в течение одного занятия.

Приготовление 10%-ных растворов углеводов.

·  0.5 г сахара растворить в 5 мл буферного раствора рН 6,0.

     Изучение кинетики действия фермента в присутствии       

     различных субстратов

     Запись кинетических кривых проводят на спектрофотометре SPECORD UV VIS на длине волны l = 350 нм (2860см^-1) и используя временную развертку 2,2 мин или 4,4 мин.

В кварцевую кювету длиной 1 см помещают:

·  0,4 мл 10%-ного раствора сахара,

·  0,5 мл КI - реактива,

·  1,1 мл буферного раствора рН 6,0.

Общий объем раствора в кювете 2 мл, конечная концентрация сахара в кювете 2%.

Термостатируют кювету с раствором при 25 ⁰С в течение 10–15 мин. Автоматической микропипеткой вносят 5 или 10 мкл раствора фермента, интенсивно перемешивают и записывают кинетическую кривую. Опыт воспроизводят 2–4 раза.

Определение количества выделившейся в результате ферментативной реакции перекиси водорода проводят по реакции с         КI-реактивом (Н₂О₂ + 3I^-  + 2Н⁺ ® 2Н₂О + I₃^-). В результате реакции образуется I₃^-, который имеет коэффициент экстинкции e = 2,5´10⁴ л/моль×см в максимуме линии поглощения при 350 нм.

Результаты записывают в таблицу:

Субстрат	Начальная скорость реакции, (мкмоль выделившейся перекиси водорода в 1 мин на 1 мкл  раствора глюкозооксидазы)	Относительная активность, %
b-D-глюкоза		100

На основании полученных данных делают вывод о специфичности действия глюкозооксидазы.

Задача К-32

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ КИСЛОРОДОМ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ

Целью данной работы является определение кинетических параметров реакции окисления глюкозы кислородом, осуществляемой ферментом глюкозооксидазой: константы Михаэлиса К_М и максимальной скорости реакции W_max.

В выбранных условиях при постоянной начальной концентрации кислорода в растворе ферментативная реакция протекает по кинетическому закону Михаэлиса–Ментен:

                                            ,      

где W – скорость ферментативной реакции, моль/л×с;

W_max – максимальная скорость реакции, моль/л×с;

K_M  – константа Михаэлиса , моль/л;

S₁ – концентрация субстрата (глюкозы), моль/л.

НЕОБХОДИМЫЕ РЕАКТИВЫ:

1.   b-D-глюкоза;

2.   9%-ный раствор молибдата натрия;