Лабораторные работы по аналитической биохимии (Количественное определение ДНК в печени. Определение активности щелочной фосфатазы. Исследование свойств щелочной фосфатазы)

Лабораторные работы по аналитической биохимии

(Выполнила: Баблюк Екатерина, гр. 8405)

Занятие 7. Количественное определение ДНК в печени

Приборы и реактивы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  10 мм кюветы;

3)  пробирки – 6 шт.;

4)  пипетки на 1, 2 и 5 мл;

5)  водяная баня (100°С);

6)  центрифужные пробирки -  2 шт.;

7)  морозильная камера (-20°С);

8)  центрифуга;

9)  ледяная баня.

Реактивы:

1)  1 М раствор NaOH;

2)  насыщенный раствор NaCl в 20 %-й CH3COOH;

3)  0,5 М раствор HClO4;

4)  реактив Дише: 1г дифениламина (дважды перекристализованный из 70%-го этилового спирта) растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) и добавляют 2,75 мл концентрированной H2SO4;

5)  96%-й этиловый спирт;

6)  стандартный раствор ДНК (300 мкг/мл).

Экспериментальная часть

а) Выделение ДНК

            Образец печени (100мг) поместить в центрифужную пробирку, добавить 1мл 1 М NaOH и при помешивании нагревать на кипящей водяной бане 5-15 мин. Прозрачный и слегка опалесцирующий гидролизат охладить до комнатной температуры (5-10 мин), затем поместить на ледяную баню, добавить 0,5 мл насыщенного раствора NaCl в 20 %-й уксусной кислоте и тщательно перемешать. Через 3-5 мин выпавший в осадок белок отделить центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин). Супернатант перенести в центрифужную пробирку, а осадок белка растворить в 1мл 1 М NaOH, вновь осадить белок добавлением 0,5 мл насыщенного раствора в 20 %-й уксусной кислоте и центрифугировать (3000 об/мин, 5 мин). Полученный супернатант объединить с предыдущим, добавить 2 объема (6мл) охлажденного спирта, тщательно перемешать и поместить в морозильную камеру (-20°С) на 30 мин. Осадок ДНК собрать центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин). К осадку ДНК добавить 2 мл 0,5 М HClO4.

б) Определение содержания ДНК по цветовой реакции на дезоксирибозу (по Дише)

К 2 мл раствора, содержащего от 30 до 300 мкг ДНК в 1 мл 0,5 М HClO4 (см. таблицу), добавить 4 мл реактива Дише.

Номер пробирки	Концентрация ДНК, мкг/мл	Стандартный раствор ДНК, мл	0,5 МHClO4, мл
1(контроль)	0	0	2
2	30	0,2	1,8
3	75	0,5	1,5
4	150	1	1
5	300	2	0
6(задача)	?	-	-

Смесь нагреть на кипящей бане 10 мин и охладить до комнатной температуры (5-10 мин). При нагревании развивается устойчивая синяя окраска. После охлаждения до комнатной температуры измерить оптическую плотность против воздуха (λ = 590 нм, кювета 10 мм). Рассчитать содержание ДНК в ткани, пользуясь калибровочным графиком, с учетом всех разведений.

Номер пробы	Концентрация ДНК, мкг/мл	Оптическая плотность, (λ = 590 нм, кювета 10 мм)
1(контроль)	0	0,055
2	30	0,12
3	75	0,245
4	150	0,39
5	300	0,75
6(задача)	?	0,35

Калибровочная кривая

Рассчитанная концентрация ДНК в ткани с учетом всех разведений составила 80 мкг/мл.

Занятие 8. Количественное определение белка в печени

Приборы и реактивы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  10 мм кюветы;

3)  пробирки;

4)  пипетки на 1, 2 и 5 мл;

5)  термостат (50°С);

6)  весы технические;

7)  секундомер;

8)  центрифуга;

9)  гомогенизатор;

10)  чашка Петри;

11) ножницы.

Реактивы:

1)  0,01 М раствор трис-НСl  pH 8,0, содержащий 0,1 М КСl и 0,05 M MnCl2;

2)  раствор №1 (2 г тартрата калия, натрия и 100 г  Na2CО3 растворить в 500 мл 1М NaOН и разбавить водой до 1 л);

3)  раствор №2 ( 2 г тартрата калия, натрия и 1 г CuSO4•5H2O растворить в 90 мл H2O и добавить 10 мл1М NaOН);

4)  раствор №3 (1 объем реактива Фолина разбавить 15 объемами воды.Раствор готовится перед употреблением и должен иметь титр между 0,15-0,18М по титрованию до рН 10,0 1М NaOН. Студенты получают уже разбавленный раствор);

5)  бычий сывороточный альбумин (БСА).

Экспериментальная часть

а) Приготовление гомогената печени

            Печень взвесить, после чего поместить в чашку Петри и тщательно измельчить ножницами. Измельченную печень суспендировать в трех объемах (в мл по отношению в весу ткани в г), 0,01 М раствор трис-НСl  pH 8,0, содержащего 0,1 М КСl и 0,05 M MnCl2, и тщательно гомогенизировать в гомогенизаторе (поршневого типа). Гомогенат центрифугировать (10 000 об/мин, 15 мин). Супернатант развести водой в 500 раз и измерить концентрацию белка.

б) Фотометрическое определение белка модифицированным методом Лоури

Приготовить в мерной колбе стандартный раствор БСА с концентрацией 100 мкг/мл. К 1 мл раствора, содержащего от 10 до 100 мкг белка (см. таблицу).

Номер пробирки	Концентрация белка, мкг/мл	Стандартный раствор белка, мл	Вода, мл
1(контроль)	0	0	1
2	100	1,00	0
3	75	0,75	0,25
4	50	0,50	0,50
5	25	0,25	0,75
6	10	0,10	0,90
7(задача)	?	-

Добавить 900мкл раствора №1 и поставить пробирки в термостат (50 °С, 10 мин). После охлаждения до комнатной температуры измерить оптическую плотность (λ = 670 нм, кювета 10 мм). Содержание белка в ткани рассчитать, пользуясь калибровочным графиком, с учетом всех разведений.