Лабораторные работы по аналитической биохимии (Количественное определение ДНК в печени. Определение активности щелочной фосфатазы. Исследование свойств щелочной фосфатазы), страница 2

Номер пробы	Концентрация белка, мкг/мл	Оптическая плотность, (λ = 670 нм, кювета 10 мм)
1(контроль)	0	0,17
2	100	0,6
3	75	0,32
4	50	0,28
5	25	0,22
6	10	0,195
7(задача)	?	0,43

Калибровочная кривая

Рассчитанная концентрация белка в ткани с учетом всех разведений составила 156 мкг/мл.

Занятие 9. Определение активности щелочной фосфатазы

Приборы и реактивы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  10 мм кюветы;

3)  пробирки;

4)  пипетки на 1, 2 и 5 мл;

5)  термостат (30°С);

6)  весы технические;

7)  секундомер;

8)  гомогенизатор;

9)  чашка Петри, лед;

10) ножницы.

Реактивы:

1)  5,5 мМ раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом буфере рН 10,0, содержащем 5 мМ MgSO4;

2)  0,01 М глициновый буфер рН 10,0;

3)  0,02 М раствор NaOH.

Экспериментальная часть

а) Приготовление гомогената почек крысы

            Крысу забить декапитацией, извлечь почки, взвесить их, поместить в чашку Петри (поставленную на лед) и тщательно измельчить ножницами. Измельченную почку суспендировать в четырех объемах (в мл по отношению к весу ткани в г) охлажденного до 0°С  0,01 М глицинового буфера рН 10,0. Суспензию перенести в гомогенизатор, помещенный в ледяную баню, и гомогенизировать до однородного состояния. Гомогенат хранить при 0°С. Для определения активности щелочной фосфатазы использовать гомогенат почек, разбавленный в 10 раз охлажденным до 0°С 0,01 М глициновым буфером рН 10,0.

б) Определение активности щелочной фосфатазы при 30°С в гомогенате почек крысы.

            Поместить пробирку с 5 мл 5,5 мМ раствора n-нитрофенилфосфата в термостат (30°С, 10 мин). После этого внести в пробирку 0,5 мл гомогената почек (разбавленного) и включить секундомер. Через 5, 10, 15, 20 и 30 мин от начала реакции из реакционной смеси отобрать пробы по 1 мл и быстро перенести в заранее приготовленные пробирки с 10 мл 0,02 М  NaOH. Измерить против воздуха оптическую плотность (λ = 400 нм, кювета 10 мм) этих растворов, а так же контрольного раствора, содержащего 11 мл 0,02 М NaOH, 1 мл 5,5 мМ n-нитрофенилфосфата и 100 мкл разбавленного гомогената (компоненты смешивать в указанной последовательности). Результаты измерений занести в таблицу.

Время реакции, мин	0(контроль)	5	10	15	20	30
D400	0,07	0,27	0,37	0,44	0,52	0,58

            Построить график в координатах D400 от t.

По начальному линейному участку кинетической кривой рассчитать скорость реакции:

Скорость реакции равна 0,04 ОЕ/мин.

            Рассчитать активность щелочной фосфатазы Е на 1 мл гомогената почек:

Е/мл гомогената почек = мкМ/мин,

где 15,2 – оптическая плотность 1мМ раствора n-нитрофенола.

Активность щелочной фосфатазы равна 3,18 мкМ/мин.

Занятие 10. Исследование свойств щелочной фосфатазы

Приборы и реактивы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  10 мм кюветы;

3)  пробирки;

4)  пипетки на 1, 2 и 5 мл;

5)  термостат (30°С);

6)  ледяная баня;

7)  секундомер.

Реактивы:

1)  5,5 мМ раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом буфере рН 8,0, содержащем 5 мМ MgSO4;

2)  5,5 мМ раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом буфере рН 10,0, содержащем 5 мМ MgSO4;

3)  5,5 мМ раствор n-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом буфере рН 12,0, содержащем 5 мМ MgSO4;

4)  0,02 М раствор NaOH;

5)  раствор щелочной фосфатазы из кишечника цыплят с активностью 0,1 ед. акт./мл в 0,01 М глициновом буфере рН 10,0, содержащем 1%-й тритон  Х-100 (хранить в процессе работы на ледяной бане).

Экспериментальная часть

а) Зависимость активности щелочной фосфатазы от рН среды

            Поместить пробирку с  5 мл 5,5 мМ раствора n-нитрофенилфосфата ( в буфере рН 8,0, 10,0 или 12,0) в термостат (30°С, 10 мин). После этого внести в пробирку 0,5 мл раствора фермента и включить секундомер. Через 5, 10, 20, 30 и 40 мин от начала реакции из реакционной смести отобрать пробы по 1 мл и быстро перенести в заранее приготовленные пробирки с 10 мл 0,02 М NaOH. Измерить против воздуха оптическую плотность (λ = 400 нм, кювета 10 мм) этих растворов, а также контрольного раствора, содержащего 11 мл 0,02 М NaOH, 1 мл 5,5 мМ n-нитрофенилфосфата и 100 мкл раствора фермента (компоненты смешивать в указанной последовательности). Результаты занести в таблицу.

Время, мин	Оптическая плотность D400
	рН 8,0	рН 10,0	рН 12,0
0(контроль)	0,1	0,1	0,095
5	0,12	0,32	0,33
10	0,16	0,465	0,46
20	0,2	0,72	0,67
30	0,26	0,87	0,84
40	0,31	0,95	0,9

            Далее на одном графике в координатах D400 от t начертить все кинетические кривые.

            По начальным линейным участкам кинетических кривых вычислить скорость реакции:

Рассчитанная скорость:

При рН 8,0: 0,02 ОЕ/мин;

При рН 10,0: 0,064 ОЕ/мин;

При рН 12,0: 0,066 ОЕ/мин.

Построить график зависимости скорости реакции от рН и определить оптимальное значение рН для реакции гидролиза n-нитрофенилфосфата фосфатазой.

Оптимальное значение рН около 10,0.