Отраженная трехмерная световая микроскопия поверхности биологических оболочек, страница 7

Так как нашей целью является отраженная микроскопия поверхностно расположенных клеток и соединительнотканных элементов, формирующих поверхность препарата, очевидно, что данная методика, способная импрегнировать соединительную ткань, потребует принципиального видоизменения. Необходимо будет исключить процедуры, направленные на подавление импрегнации соединительной ткани.

Для нас важно отметить, что импрегнация аммиачными растворами серебра по Бильшовскому выявляет абсолютное большинство клеточных и межклеточных структур соединительной ткани, включая  эпителиальные, нервные  и сосудистые конструкции. Есть модификации способа Бильшовского направленные на дифференцированное выявление отдельных структур тканей.

Импрегнация пленочных препаратов для отраженной микроскопии соединительно-тканных структур.

Из множества модификаций метода Бильшовского мы пользуемся модификацией по Гомори, существенно сокращающей время изготовления препарата. Кроме того, применение едкого калия, вместо едкого натрия по Бильшовскому, при приготовлении аммиачного раствора серебра, очевидно, приводит к лучшей дифференцировке отдельных коллагеновых волокон, демаскируя их больше. К примеру, при импрегнации соединительной ткани по способу Гросс-Шульце, при котором аммиачный раствор серебра готовится без добавления щелочи, отдельные коллагеновые волокна дифференцируются хуже. В способ Гомори нами внесены изменения:

1)  учитывая значительно большую, по сравнению с микротомными срезами, толщину пленочного препарата, продлена экспозиция в рабочих растворах до 10 минут, для равномерного восстановления серебра концентрация проявляющего раствора формалина снижена до 1%.

2)   восстановления серебра доводится до металлического состояния - до черного цвета препарата

3)  исключена промывка между этапами в дистиллированной воде

·  Предварительная подготовка материала как обычно:

1)  фиксация пленок как обычно в 10% вормалине 1-2 недели, или одни сутки в 20% формалине в термостате при температуре 38 град. С. (или 3 часа при 56 град. С.) с последующей промывкой в обычной воде  5 мин 

2)  3 минуты в 0,5-1% растворе перманганата калия

3)  промывка в обычной воде 5 мин 

4)  обесцвечивание в 1-3% растворе метабисульфита калия 3 мин

5)  промывка в обычной воды 10 минут (для выявления коллагена промывки лучше проводить в дистиллированной воде)

·  Импрегнация:

1)  сенсибилизация в 10% растворе азотнокислого серебра 10 минут

2)  удаление избытка раствора фильтровальной бумагой отсасыванем

3)  импрегнация в свежем аммиачном растворе серебра 10 минут

4)  удаление избытка раствора фильтровальной бумагой отсасыванием

5)  восстановление серебра в 1% формалине на обычной воде пошевеливая до черного или пепельного-черного цвета препарата (до 10 минут). Коллаген более избирательно выявляется в 1% растворе формалина на  дистиллированной воде.

·  Далее как обычно:

1)  остановка проявления в аммиачной воде

2)  промывание в дестиллированной воде

3)  удаление невосстановленного серебра в фиксаже (5% раствор гипосульфита), 5 мин

4)  промывка, обезвоживание и заключение в бальзам.

Можно микроскопировать расправленный незаключенный препарат в отраженном свете после последней промывки (Рис.11).

Приготовление аммиачного раствора серебра. К 10 мл 10% раствора азотнокислого серебра прибавить 2 мл 10% едкого калия. Осадок растворить аммиаком, взбалтывая после каждой капли. Прибавить каплю за каплей 10% раствор азотнокислого серебра (обратное титрование, для более точного уменьшения аммиака в растворе) пока появляющийся осадок не начнет исчезать при встряхивании с трудом. Прилить дистиллированную воду до удвоения объема.

1

2

Рис.11.   Поверхность диафрагмальной брюшины человека. Эпителий удален мацерацией и промывкой. Импрегнация  соединительной ткани для отраженной микроскопии, не заключенный расправленный препарат. Слева (1) участок базальной мембраны с отверстиями подлежащего «люка». Справа базальная мембрана удалена механически, обнажен «люк» (2), представляющий собой межволокнистую, межклеточную без  матрикса  тканевую щель. Отраженная микроскопия в «темном поле зрения» через «Вертивал» (К.Цейсс) при одностороннем косопадающем освещении со стороны верхней кромки рисунка. Эпиобъектив 25. Окуляр 12,5.

При импрегнации для отраженной микроскопии тонких пленок (к примеру, дифрагмальной плевры, рис. 12) можно применить комбинированную микроскопию – сочетание отраженной микроскопии с просвечивающей. Так рисунки 12а и 12в, одного и того же участка препарата без перефокусировки микроскопа представлены для демонстрации целесообразности применения отраженной микроскопии поверхности препаратов для получения дополнительной информации о ней.

4

4

1

1

2

2

3

3

3