Биология \ Микробиология

Отраженная трехмерная световая микроскопия поверхности биологических оболочек, страница 2

В свою очередь, методы восстановления импрегнированного серебра соответствуют технологии «реакции серебряного зеркала». Так добавление к аммиачному раствору азотнокислого серебра нескольких капель формальдегида или раствора глюкозы приводит к восстановлению ионов серебра в растворе в металлическое серебро (Селезнев К.А.,1973; Глинка Н.Л., 1977). Полное восстановление серебра в структурах импрегнированных препаратов придает им светоотражательную способность, что делает такие препараты пригодными для падающей отраженной микроскопии. Прозрачность препаратов, изготовленных для отраженной световой микроскопии и предназначенных, в основном, для исследования структур их поверхности, не имеет решающего значения. Но, наличие прозрачности (тонкие пленки) резко повышает информативность микроскопии таких препаратов: структуры поверхности и ее рельеф исследуются трехмерной микроскопией в отраженном свете, а внутреннее строение препарата и идентификация элементов его поверхности - микроскопией на просвет, переключением освещения. Микроскопическая картина при отраженной световой микроскопии является «позитивной» - исследуемые светоотражающие структуры являются более светлыми, чем окружающее их «темное поле зрения». То есть отраженная световая микроскопия физиологическая (и менее утомляемая) для органа зрения – глаза адаптируются на более светлые исследуемые структуры и поэтому работают с большей разрешающей способностью по сравнению с микроскопией на просвет.

Таким образом, для трехмерной светооптической микроскопии гистологических препаратов необходимо создание двух условий:

- Придание светоотражательной способности исследуемым гистологическим структурам.

- Тенеобразующее освещение препарата со стороны объектива.

2. Аппаратное обеспечение отраженной световой микроскопии биологических объектов и гистологических препаратов.

2.1. Аппаратное обеспечение макро-микроскопического (анатомического) уровня исследований.

Подготовленные для светоотражения крупные объекты или готовые макро-микро препараты препарируются или микроскопируются под стереомикроском (МБС-9 фирмы ЛОМО или других фирм). Боковое падающее освещение осуществляется имеющимся переносным источником света. Для избавления от бликов, возникающих на поверхности сухих или влажных макро-микро препаратов, последние погружаются в плоскую чашку с дистиллированной или чистой водопроводной водой. Предварительное кипячение уменьшает появление в этой водной среде, мешающих микроскопии, воздушных пузырьков. Для прикрепления препарата и придания ему определенного положения на дно чашки можно прилепить пластичный материал.

2.2. Аппаратное обеспечение гистологического уровня исследований.

Светоотражающие заключенные гистологические препараты или незаключенные, хранящиеся в водно-спиртовом растворе или глицерине, пленки можно микроскопировать в отраженном свете с помощью обычных светооптических микроскопов. Для обеспечения одностороннего бокового падающего освещения необходим переносной источник света (Рис. 4) мощностью не менее 50 ватт, с конденсором и переменным фокусом. Хорошего качества микроскопическую картину можно получить с объективами до 50-кратного увеличения (3,5; 4; 6,3; 8; 9; 10; 12; 16; 25; 40 и 50). При большем увеличении четкость изображения теряется из-за несовершенства освещения. Обычно применяемый угол наклона светового луча, равный примерно 30-45 град., можно уменьшать до 5-10 град. при применении короткофокусных или большого диаметра объективов, заслоняющих боковой свет. Интересующие участки просвечивающихся препаратов можно микроскопировать и на просвет, переходом на освещение снизу.

С большим успехом и удобнее пользоваться микроскопами смешанного или падающего освещения, оснащенными эпиобъективами. Это могут быть традиционные «металлографические» (О.В.Егорова, 2000) и исследовательские микроскопы: МБИ-15, Биолам-И, Вертивал, Йенавал, Эпивал, Аксиоскоп-2. Метод освещения «светлое поле зрения» (Рис.5) мало пригоден для отраженной световой микроскопии. Свет, падающий из объектива и идущий по его оси, не образует видимые тени деталей препарата (тени не выходят за контуры тенеобразующей структуры). К тому же такой свет, падая перпендикулярно к поверхности покровного стекла заключенного препарата, или к поверхности смачивающей жидкости не заключенного пленочного препарата, к поверхности самого препарата, является интенсивно бликообразующим на границе раздела этих сред. Необходимо пользоваться освещением в «темном поле зрения», создающем круговое (кольцевое) косопадающее освещение (Рис.6; 10а). Такое освещение позволяет микроскопировать детали тканевой организации поверхности препарата в отраженном свете без выявления мелких и пологих перепадов ее рельефа. При этом теневой контраст визуализирует глубокие борозды с круто падающими берегами, которые затемняются (не освещаются) и при кольцевом косопадающем освещении, а возвышения рельефа слабо визуализируются из-за кругового бестеневого освещения его склонов. Для более детального исследования строения рельефа поверхности препарата круговое косопадающее освещение необходимо преобразовать в одностороннее косопадающее