Отраженная трехмерная световая микроскопия поверхности биологических оболочек

Отраженная трехмерная световая микроскопия поверхности биологических оболочек.

1.  Кратко об идеологии трехмерной световой микроскопии

            Исследование гистологических препаратов основано на микроскопии прозрачных окрашенных срезов или пленок на всю их глубину просвечиванием снизу («сзади» объекта). При этом исследуется внутреннее строение селективно окрашенных структур (клеток, волокон, их детали и агрегаты). Отметим очевидное методологическое противоречие в идеологии микроскопии поверхности различных структур на просвет (к примеру, рельефа поверхности и самой поверхности естественных оболочек), как «исследование внутреннего строения» границы раздела сред. Для исследования поверхности объекта необходимо освещать эти поверхности снаружи (а не изнутри), со стороны наблюдателя. При этом создаются естественные условия освещения, формирующие обычное объемное - трехмерное восприятие формы наблюдаемого объекта.

Для получения трехмерной картины структур гистологического препарата с помощью светооптических  микроскопов необходимо добиться визуализации параметров (протяженности) всех трех основных осей пространства. То есть одновременно видеть последовательность чередования структур препарата по трем осям пространства. В данном случае речь идет не (не только) о бинокулярном трехмерном зрении, не о бинарных «стереомикроскопах» с двумя оптическими системами, а об обычных «плоскопольных» микроскопах с одним объективом. Речь идет о трехмерном восприятии пространства из одной точки осей координат, подобно тому, как это происходит у большинства позвоночных с боковым положением глаз, у человека при закрытии одного глаза, через одинарный объектив фото и видеокамер.

Визуальная оценка последовательности расположения структур по оси Y (вертикальная ось) и оси X (фронтальная ось), расположенных во фронтальной плоскости объектива – плоскости поля зрения и гистологического препарата - происходит, соответственно, по направлениям верх-низ и вправо-влево по полю зрения.

Визуализация взаиморасположения выявляемых структур вглубь препарата вдоль переднезадней - сагиттальной оси пространства поля зрения (ось Z – Рис.1. - вдоль продольной оси объектива; перпендикулярно фронтальной плоскости, плоскости поля зрения и препарата) в пределах глубины резкого изображения объектива невозможна при микроскопии на просвет (Рис.2.). Просвечивание объекта сзади формирует «обратную» тень, то есть задние, глубинные структуры объекта отбрасывают тень на передние, поверхностные его структуры. При таком освещении невозможна зрительная оценка последовательности расположения отдельных структур вглубь препарата в направлении объектив (глаз) – источник света. В свою очередь, отсутствие оценки последовательности расположения структур по одной из осей 3-х мерного пространства приводит в целом к потере зрительного восприятия объемности микроскопической картины. К тому же отметим, что микроскопическая картина при освещении на просвет обычно является «негативным» изображением, то есть исследуемые структуры являются более темными на светлом поле зрения. Такая микроскопия, в этом плане, в какой-то степени напоминает «театр теней» полупрозрачных объектов, если сопоставить поле зрения микроскопа с плоским театральным экраном.

Визуализировать взаиморасположение и изменения формы выявляемых структур по переднезадней оси (ось Z) можно созданием эффектов естественного наружного освещения. Во-первых, передние структуры при этом будут заслонять освещение задних структур, и передние структуры могут формировать видимые «прямые» - отбрасываемые спереди назад – тени. Во-вторых, передние и боковые поверхности исследуемых объектов будут иметь различную яркость освещения, обусловленную их разной ориентацией к источнику света и наблюдателю (а не степенью поглощения света). Эти эффекты могут быть созданы при освещении гистологического препарата «спереди» - со стороны объектива (глаза), то есть микроскопией гистологического препарата в падающем свете. Носителем информацию о структуре препарата будет отраженный от него в объектив свет (микроскопия в падающем отраженном свете). Соответственно, препарат должен быть изготовлен не для получения картины градиента поглощения света красителями в различных структурах, а для получения картины светоотражения красителей в (на) исследуемых структурах. При этом светоотражающая поверхность препарата или отдельных его структур будет заслонять и затенять глубжележащие структуры. Чтобы была заметна световая тень, падающая от поверхностно расположенных структур, она должна быть направлена косо к плоскости поля зрения и выходить за контуры этих структур (Рис.3.), то есть не перпендикулярно к плоскости препарата, а под острым углом к ней. При этом затемняется одна из боковых сторон исследуемой структуры. Боковое освещение должно быть односторонним, чтобы тень, созданную одним источником света не освещать другим источником. Изменяя направление - азимут освещения препарата поворотом предметного столика (Рис.10а и 10б) можно добиться лучшей визуализации различно ориентированных по полю зрения структур (борозд, валиков, регулярной волнистости поверхности и др.). Угол падения света на препарат должен быть тем меньше, чем мельче исследуемая структура.

			Рис.2.  Микроскопия на просвет

 

Для микроскопии гистологических препаратов в падающем свете исследуемые структуры препарата должны обладать светоотражательной способностью. Хорошей светоотражательной способностью обладают металлы, а наилучшей среди них – серебро, коэффициент светоотражения которого достигает 95% (Оленин С.С., Фадеев Г.Н.,1979).     Разработано множество способов селективной окраски различных структур гистологических препаратов растворами солей серебра. На начальном этапе такой окраски серебро импрегнируется в препарат в виде растворов его солей и осаждается на исследуемых структурах (имеется множество способов предварительной избирательной сенсибилизации различных структур к солям серебра). На завершающем этапе окраски проводится восстановление серебра на сенсибилизированных структурах, а фоновый остаток его отмывается. Методы импрегнации препаратов серебром разработаны для обычной микроскопии в проходящем свете и не пригодны для микроскопии их в отраженном свете. Во-первых, применение методов импрегнации серебром связано с высокой светопоглощающей способностью восстановленного серебра и промежуточных продуктов его восстановления, что обеспечивает высококонтрастное изображение структур при микроскопии на просвет. Восстановление серебра при этом не доводится до металлического состояния, останавливаясь на промежуточных этапах реакции его восстановления до желто-коричневого цвета препарата. Полное восстановление импрегнированного серебра до металлического состояния - до пепельно-серого, черного цвета препарата, резко снижает прозрачность последнего, приводя его или исследуемые структуры в непригодное для микроскопии на просвет состояние. Во-вторых, все способы импрегнации включают межэтапное отмывание серебра с поверхности препарата (проводка препаратов через несколько порций дестиллированной воды как после этапа сенсибилизации азотнокислым серебром, так и после этапа экспозиции в аммиачном растворе серебра). Тем самым исключается осаждение серебра на поверхности препарата и снижается импрегнация поверхностно лежащих его структур. В противном случае препарат становится непрозрачным и непригодным для микроскопии на просвет из-за осаждения металлического серебра на поверхности препарата с обеих его сторон и переимпрегнации поверхностных его структур за время диффундирования растворов в глубину препарата. Особенно, сказанное относится к импрегнации сравнительно большой толщины пленочных препаратов биологических оболочек, когда межэтапное отмывание серебра проводится более длительно и проявление его производится в восстанавливающих растворах (формалина) очень низкой концентрации, обладающих также отмывающим эффектом.