Лабораторная работа
Цель занятия: с помощью современных методических подходов рассмотреть основные закономерности влияния ионизирующего излучения на физико-химические характеристики биологических мембран
Теоретическая часть
Радиационно-индуцированные поражения биологических мембран.
Согласно современным представлениям биологические мембраны играют определяющую роль в жизнедеятельности клетки: участвуют в поддержании клеточного гомеостаза, в регуляции межклеточных взаимодействий, в генерации мембранных потенциалов, в формировании антигенной экспрессии, а также в осуществлении множества других процессов.
Проблема исследования действия радиации на компоненты биологических мембран в настоящее время является весьма актуальной. Вопрос о том, какие компоненты мембран наиболее радиочувствительны, и по каким механизмам осуществляется радиационное поражение, чрезвычайно важен для понимания последствий воздействия радиации на организм. В настоящее время накоплен обширный материал об относительной радиочувствительности белковой и липидной фаз биологических мембран.
Многочисленными исследованиями обнаружено уменьшение доли суммарных липидов и накопление холестерина, увеличение количества липоперекисей и перераспределение фракций индивидуальных фосфолипидов в мембранах клеток облученного организма. Усиление перекисного окисления мембранных липидов после действия ионизирующей радиации является одним из наиболее изученных мембранных эффектов облучения. Этот процесс, при котором липиды клеточных мембран окисляются молекулярным кислородом до перекисей и других продуктов, постоянно протекает в клетках и в норме, являясь одним из важных звеньев регуляции их метаболизма и функций, например, при старении и неопластической трансформации. Возникающие в процессе окислительно-восстановительных реакций свободные радикалы атакуют липиды в местах двойных связей ненасыщенных жирных кислот, давая начало цепным процессам ПОЛ. Эти процессы приводят к образованию гидроперекисей и продуктов их разрушения, изменяющих состояние липидного бислоя, а также являются токсичными для клеток.
В норме процессы ПОЛ сдерживаются специальными защитными антиоксидантными ферментными системами и небелковыми молекулами-антиоксидантами. Ферменты антирадикальной защиты составляют "первую линию обороны" клеточных мембран от атаки кислородных радикалов. Так, например, супероксиддисмутаза (СОД) катализирует дисмутацию кислорода в перекись водорода и молекулярный кислород. Биоантиоксиданты - вторая линия защиты - снижают до минимума повреждения, наносимые ОН· и другими радикалами, блокируя развитие цепи ПОЛ. Наиболее важными антиоксидантами являются: токоферол, аскорбиновая кислота и каротин.
Усиление ПОЛ биомембран после действия ионизирующей радиации может вызываться двумя причинами. Во-первых, это увеличение числа радикалов, возникающее как в результате радиолиза воды и других низкомолекулярных соединений и атакующих двойные связи жирных кислот, так и радикалов, возникающих в липидах в итоге прямого действия облучения. Каждый из таких радикалов в присутствии кислорода может инициировать цепь ПОЛ. Во-вторых, усиленный расход биоантиоксидантов и специализированных ферментных систем, вызванный необходимостью ликвидации вызванного облучением перекисного окисления, неизбежно приведет к снижению их количества в мембранах, что может вызвать в дальнейшем усиление ПОЛ, инициированное радикалами биологического происхождения.
Изучение влияния радиации на физические свойства мембранных липидов их текучесть и полярность производится в основном двумя способами: методом электронного парамагнитного резонанса (путем использования ЭПР-зондов), а также методом флуоресцентных мембранных зондов. С помощью данных методов можно регистрировать радиационно-индуцированные изменения физико-химических характеристик биологических мембран.
В целом можно представить последовательность событий, протекающих в облученных липидах, следующим образом. Индуцированные радиацией процессы перекисного окисления будут приводить, во-первых, к изменениям физических свойств липидов – к возрастанию их жесткости и оводненности, и, во-вторых, к изменениям фосфолипидного состава мембран, к росту доли трудно окисляемых фосфолипидов с высоким содержанием насыщенных жирнокислотных остатков. В свою очередь, снижение доли полиненасыщенных жирных кислот будет увеличивать вязкость биомембран.
Контрольные вопросы.
1. Каковы современные представления о структурно-функциональной организации биологических мембран.
2. Какова относительная радиочувсвительность основных мембранных компонентов.
3. Какие процессы способствуют активации процессов ПОЛ биомембран при облучении.
4. Каковы последствия радиационно-индуцированной перестройки биологических мембран.
5. Какие методические подходы используются для оценки воздействия радиации на физико-химические характеристики биологических мембран.
Практическая часть
Задание 1. Выделение клеток вилочковой железы.
Материалы и оборудование: крысы 6-8-месячные (контрольные и облученные животные), весы аналитические, ножницы, пинцет анатомический, нейлоновое сито, чашки Петри, пастеровская пипетка, пробирки центрифужные, лед (холодовой элемент), центрифуга, натрий-фосфатный буфер (PBS), содержащий NaCl - 140 мМ, KCl - 5 мМ, Na2HPO4 -1 мМ, D-глюкоза - 5,5 мМ, pH 7.4), фиколл-верографин (р=1,087).
Ход работы:
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.
