Ферменты. Строение и механизм действия. Кинетика ферментативных реакций, страница 5

Постулируется, что продукт реакции, Р, не превращается в исходный субстрат S (3).

Равновесие устанавливается очень быстро, и вторая стадия реакции необратима (лимитирующая стадия) (4), скорость ферментативной реакции выражается как

V = k₂[ES].                                   (II)

В квазистационарных условиях (5) концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, т. е. d[ES] / dt = 0:

k₁[E][S] = (k_-1 + k₂)[ES] .                    (III)

Преобразуем это уравнение:

                       [E][S]

[ES]=       .    (IV)

(k_-1 + k₂)/k₁        

Вводим новую константу К_М - константу Михаэлиса:

                 К_М = (k_-1 + k₂)/k₁,                          (V)

тогда уравнение (IV):

[E][S]

             [ES]  =                                   .                    (VI)

        К_М                                                                            

Концентрация субстрата не меняется в ходе реакции, т. е. концентрация свободного субстрата равна его начальной концентрации при условии, что [E] << [S] (6), тогда как концентрация несвязанного Е:

   [E] = [Е]_о – [ES],                            (VII)

где [Е]_о – общая концентрация фермента.

Подставим это выражение в уравнение (VI) и решим относительно [ES]:

                      [S]

[ES]  =  [Е]_о                         .                           (VIII)

                                                           [S] + К_М                                                                     

Подставим выражение (VIII) в уравнение (II):

                                 [S]

V    =   k₂ [Е]_{о                                         .}                                        (IX)

                                                              [S] + К_М                 

Максимальная скорость реакции V_max достигается при насыщении  активных   центров  фермента   субстратом,  т. е.  когда

[S] >> К_М, при этом [S] / [S] + [К_М] » 1. Следовательно,

V_max = k₂[E]_o.                                        (X)

Подставив это выражение в уравнение (IX), получим уравнение Михаэлиса–Ментен:

                              [S]

V = V_max                                                                                               (XI)

                                                 [S] + К_М                                       

или            

V_max

V =                         .                             (XII)

                                               1 + К_М/[S]                                   

Эти уравнения соответствуют кинетической зависимости, представленной на графике выше. При низких концентрациях S, когда S << К_М, V = V_max / К_М [S], т. е. скорость прямо пропорциональна концентрации S. При высоких концентрациях S, когда S >> К_М, V = V_max, т. е. скорость максимальна и не зависит от концентрации S.

Если [S] = К_М, то V = V_max / 2. Таким образом, физический смысл величины К_М заключается в том, что она равна концентрации S, при которой скорость реакции составляет половину максимальной.

Величины К_М и V_max варьируют в широком диапазоне для различных ферментов (табл. 4, 5).

Для  большинства  ферментов  величина  К_М  лежит  в  пределах

10^-1 - 10^-6 М. Значение К_М зависит от природы S, от условий реакции: ионной силы, температуры, рН.

Таблица 4

Величины К_М  для различных  ферментов

Фермент	Субстрат	КМ, М
Химотрипсин	Ацетил L-триптофанамид	5×10-3
Карбоангидраза	СО2	8×10-3
Аргинин-тРНК-
синтетаза	Arg	3×10-6
	тРНК	4×10-7
	АТР	3×10-4

К_М  связана  с  константами  скоростей  отдельных  стадий  катализа

К_М = (k_-1 + k₂)/k₁ (V). В случае, когда диссоциация комплекса ES на E и S протекает быстрее, чем образование Е и Р, имеет место соотношение: k₂ << k_-1 и

k_-1          [E][S]

К_М =     =                   ,

k₁        [ES],

т. е. К_М = K_ES. Таким образом, второе смысловое значение К_М: К_М равна константе диссоциации ES-комплекса, если k₂ намного меньше, чем k_-1 (7-еограничение).

В данном случае К_М является мерой прочности ES-комплекса, мерой сродства (аффинности) субстрата к Е: чем меньше величина К_М, тем выше сродство.