Лабораторные работы по аналитической биохимии (Количественное определение фруктозы. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом)

Лабораторные работы по аналитической биохимии

(Выполнила: Баблюк Екатерина, гр. 8405)

Занятие 1. Количественное определение фруктозы

Приборы и реактивы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  10 мм кюветы;

3)  пробирки;

4)  пипетки на 200 мкл, 1 и 5 мл;

5)  водяная баня (80°С);

6)  весы аналитические;

7)  мерная колба;

8)  0,1%-й раствор резорцина в этиловом спирте;

9)  30%-й раствор соляной кислоты;

10) фруктоза;

11) раствор фруктозы неизвестной  концентрации (задача).

Экспериментальная часть

а) Построение калибровочной кривой

  Приготовить в мерной колбе стандартный раствор фруктозы с концентрацией 100 мкг\мл. Из этого раствора приготовить в пробирках 5 рабочих растворов с концентрациями 20, 30, 40, 50 и 60 мкг/мл и один контрольный раствор, согласно таблице.

Номер раствора	Концентрация фруктозы, мкг/мл	Объем стандартного раствора фруктозы, мл	Вода, мл
1(контроль)	0	0	1
2	20	0,2	0,8
3	30	0,3	0,7
4	40	0,4	0,6
5	50	0,5	0,5
6	60	0,6	0,4

В каждую пробирку с рабочим раствором прилить по 1 мл 0,1%-го раствора резорцина и по 3 мл 30%-й соляной кислоты. Смесь тщательно перемешать и поставить пробирки на водяную баню (80°С) на 8 мин. После охлаждения измерить оптическую плотность против воздуха (λ = 440 нм, кювета 10 мм). По полученным данным (с учетом контроля) построить калибровочную кривую в координатах: концентрация фруктозы в мкг/мл - оптическая плотность.

Номер раствора	Концентрация фруктозы, мкг/мл	Оптическая плотность (λ = 440 нм, кювета 10 мм)
1(контроль)	0	0,0725
2	20	0,1275
3	30	0,1775
4	40	0,2275
5	50	0,2925
6	60	0,3675

Калибровочная кривая

б) Определение концентрации фруктозы

            В качестве задачи предлагается определить концентрацию фруктозы в растворе, содержащем от 100 мкг до 1 мкг фруктозы в 1 мл. Для определения концентрации фруктозы в растворе (задача) сделать три разведения (в 5, 10 и 20 раз) данного раствора. Далее к аликвотам (1 мл) полученных растворов добавить резорцин и соляную кислоту, нагреть на водяной бане и измерить оптическую плотность, как описано ранее. По калибровочному графику определить содержание фруктозы в пробе.

Разведение (раз)	Оптическая плотность( без контроля)
5	0,3025
10	0,1325
20	0,1075

            С помощью калибровочной кривой была определена концентрация фруктозы в растворе: 207,5 мкг/мл.

Занятие 2. Количественное определение ксилозы

Приборы и реактивы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  3 мм кюветы;

3)  пробирки;

4)  пипетки на 200 мкл, 1 и 5 мл;

5)  водяная баня (100°С);

6)  весы аналитические;

7)  мерная колба;

8)  раствор орцина (отдельно готовится 0,1%-й раствор хлорного железа в концентрированной соляной кислоте, а на солянокислом растворе хлорного железа готовится 0,1%-й раствор орцина);

9)  ксилоза;

10) раствор ксилозы неизвестной  концентрации (задача).

Экспериментальная часть

а) Построение калибровочной кривой

            Приготовить в мерной колбе стандартный раствор ксилозы с концентрацией 200 мкг\мл. Из этого раствора приготовить в пробирках 5 рабочих растворов с концентрациями 40, 80, 120, 160 и 200 мкг/мл и один контрольный раствор, согласно таблице

Номер раствора	Концентрация ксилозы, мкг/мл	Объем стандартного раствора ксилозы, мл	Вода, мл
1(контроль)	0	0	2
2	40	0,4	1,6
3	80	0,8	1,2
4	120	1,2	0,8
5	160	1,6	0,4
6	200	2,0	0,0

В каждую пробирку с рабочим раствором прилить по 2 мл раствора орцина. Смесь тщательно перемешать и поставить пробирки на водяную баню (100°С) на 20 мин. После охлаждения измерить оптическую плотность против воздуха (λ = 590 нм, кювета 3 мм). По полученным данным (с учетом контроля) построить калибровочную кривую в координатах: концентрация ксилозы в мкг/мл - оптическая плотность.

Номер раствора	Концентрация ксилозы, мкг/мл	Оптическая плотность (λ = 590 нм, кювета 3 мм)
1(контроль)	0	0,110
2	40	0,185
3	80	0,265
4	120	0,320
5	160	0,330
6	200	0,445

Калибровочная кривая

б) Определение концентрации ксилозы

            В качестве задачи предлагается определить концентрацию фруктозы в растворе, содержащем от 400 мкг до 2 мкг фруктозы в 1 мл. Для определения концентрации фруктозы в растворе (задача) сделать три разведения (в 5, 10 и 20 раз) данного раствора. Далее к аликвотам (2 мл) полученных растворов добавить орцин, нагреть на водяной бане и измерить оптическую плотность, как описано ранее. По калибровочному графику определить содержание ксилозы в пробе.

Разведение (раз)	Оптическая плотность( без контроля)
5	0,25
10	0,14
20	0,16

            С помощью калибровочной кривой была определена концентрация фруктозы в растворе: 420 мкг/мл.