Лабораторные работы по аналитической биохимии (Количественное определение фруктозы. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом), страница 4

3)  пробирки химические – 3 шт.;

4)  термостат (37°С);

5)  пипетки на 40мкл и 5 мл.

Реактивы:

1)  ферментативный реагент (0,4 ед. акт. холестеролэстеразы, 0,2 ед. акт. холестеролоксидазы, 1,0 ед. акт. пероксидазы, 0,564 мг фенола, 0,103 мг 4-аминоантипирина в 1 мл 0,1 мМ фосфаного буфера рН 7,0);

2)  стандартный раствор холестерина.

Экспериментальная часть

            В три пробирки внести по 3 мл ферментативного реагента, поместить их в термостат на 5 мин. Затем добавить в  эти пробирки по 30 мкл соответствующего компонента: в первую – сыворотки крови, во вторую – дистиллированной воды (контрольный раствор), в третью – стандартного раствора холестерина, перемешать и выдержать в течение 25 мин при 37°С.

            Измерить оптическую плотность (λ = 490 нм, кювета 3 мм) против воздуха. Окраска стабильна в течение 1 часа. По концентрации стандартного раствора рассчитать концентрацию холестерина в сыворотке крови.

Номер раствора	Концентрация холестерина, моль/л	Оптическая плотность (с учетом контроля)
1 (сыворотка крови)	?	0,045
2 (контроль)	0	0,055
3 (стандартный раствор)	4,65 ммоль/л	0.065

            По концентрации стандартного раствора установлена концентрация холестерина в сыворотке крови, которая составила 3,2 ммоль/л.

б) Количественное определение мочевины

Приборы и материалы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  10 мм кюветы;

3)  пробирки химические – 11 шт.;

4)  термостат (37°С);

5)  пипетки на 40мкл, 200мкл, 1 мл и 5 мл.

Реактивы:

1)  реагент 1 (8,0 ед. акт. уреазы в 1 мл 0,035 мМ фосфатного буфера рН 7,0 с 10%-ным глицерином);

2)  реагент 2 (раствор салицилата натрия (35 ммоль/л) и нитропруссида натрия (5ммоль/л));

3)  реагент 3 (раствор гипохлорита натрия (15 ммоль/л) и гидроксида натрия (112 ммоль/ л));

4)  мочевина.

Экспериментальная часть

            Для построения калибровочной кривой приготовить стандартные растворы мочевины с концентрациями 2, 4, 6, 8 и 10 мМ. Для этого сначала необходимо приготовить в мерной колбе 10 мМ раствор мочевины, а затем в соответствии с таблицей в пронумерованные пробирки (1-4) внести соответствующее количество приготовленного раствора мочевины и воды.

Номер пробирки	Концентрация мочевины, мМ	10 мМ раствор мочевины, мл	Вода, мл
1	2	2	8
2	4	4	6
3	6	6	4
4	8	8	2

            Для определения концентрации мочевины в семь чистых пронумерованных пробирок внести по 500 мкл реагента 1 и поместить их в термостат на 5 мин. Далее добавить в пробирки 1-5 по 10 мкл соответствующего стандартного раствора мочевины (от 2 до 10 мМ), в шестую пробирку добавить 10 мкл сыворотки крови, в седьмую – 10 мкл воды (контрольная проба). Перемешать и выдержать 5 мин при 37°С.

            Измерить оптическую плотность против воздуха (λ = 670 нм, кювета 10 мм). Окраска стабильна в течение 2 часов. По полученным значениям оптической плотности построить калибровочную кривую и определить по ней концентрацию мочевины в сыворотке крови.

Номер пробирки	Концентрация мочевины, моль/л	Оптическая плотность
1	2	0,11
2	4	0,19
3	6	0,34
4	8	0,36
5	10	0,41
6 (сыворотка крови)	?	0,34
7 (контроль)	0	0,065

Калибровочная кривая

            С помощью калибровочной кривой установлена концентрация мочевины в сыворотке крови. Она составила 7,75 ммоль/л.