Лабораторные работы по аналитической биохимии (Количественное определение фруктозы. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом), страница 3

            Поместить в ледяную баню четыре центрифужные пробирки с 1 мл 10%-й ТХУ в каждой. В химическом стакане приготовить реакционную смесь: к 0,2 г дрожжей добавить 5 мл воды и размешать до получения однородной суспензии, затем добавить 1 г глюкозы и 5 мл фосфатной смеси, размешать. До начала брожения отобрать 1 мл реакционной смеси (нулевая проба) и быстро перенести в одну из приготовленных пробирок с ТХУ, охлажденной до 0°С. Оставшуюся после отбора нулевой пробы реакционную смесь поместить в термостат на 37°С. Через 20,40 и 60 мин от начала брожения из реакционной смеси отобрать пробы по 1 мл и перенести их в пробирки с ТХУ охлажденной до 0°С. ТХУ осаждает белки и тем самым прекращает брожение. Осаждение белков должно длиться минимум 10 минут. Выпавший в осадок белок отделить  центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин, 0-4°С). Из полученных супернатантов отобрать по 0,5 мл для определения концентрации фосфата.

б) Построение калибровочной кривой

            Для построения калибровочной кривой в соответствии с таблицей в пронумерованные пробирки (1-5) внести соответствующее количество стандартного раствора фосфата и воды.

Номер пробирки	Содержание фосфата в пробе, нмоль	0,1мМ раствор фосфата, мл	Вода, мл
1(контроль)	0	0	2,7
2	10	0,1	2,60
3	25	0,25	2,45
4	50	0,5	2,20
5	75	0,75	1,95
6	100	1,00	1,70

            Во все пробирки добавить по 30 мкл 1%-го раствора тритона Х-100 и тщательно перемешать. С интервалом в 3 мин в пробирки внести по 300 мкл молибдата аммония и сразу тщательно перемешать. После добавления молибдата в первую пробирку включить секундомер. Точно через 20 мин измерить оптическую плотность против воздуха (λ = 670 нм, кювета 3 мм) в первой пробирке и с интервалом в 3 мин в последующих. По полученным значениям оптической плотности построить калибровочную кривую.

Номер пробирки	Содержание фосфата в пробе, нмоль	Оптическая плотность (λ = 670 нм, кювета 3 мм)
1(контроль)	0	0,0470
2	10	0,0950
3	25	0,115
4	50	0,190
5	75	0,258
6	100	0,310

Калибровочная кривая

в) Определение концентрации фосфата

            Для определения концентрации фосфата в реакционной смеси в пробирки внести 0,5 мл соответствующего супернатанта и 2,2 мл воды. Далее во все пробирки добавить по 30 мкл 1%-го раствора тритона Х-100 и тщательно перемешать. С интервалом в 3 мин в пробирки внести по 300 мкл молибдата аммония и сразу тщательно перемешать. После добавления молибдата в первую пробирку включить секундомер. Точно через 20 мин измерить оптическую плотность против воздуха (λ = 670 нм, кювета 3 мм) в первой пробирке и с интервалом в 3 мин в последующих пробирках. Используя калибровочную кривую, определить концентрации неорганического фосфата в реакционной смеси. Построить график зависимости концентрации неорганического фосфата в реакционной смеси от времени.

Проба	Оптическая плотность( без контроля)	Концентрация фосфата, мкл/мл
1	0,303	98
2	0,223	64,5
3	0,113	24
4	0.083	14

График зависимости концентрации неорганического фосфата в реакционной смеси от времени

Занятие 5. Количественное определение холестерина и мочевины.

а) Количественное определение холестерина в сыворотке крови

Приборы и материалы:

1)  фотоэлектроколориметр;

2)  3 мм кюветы;