Отраженная трехмерная световая микроскопия поверхности биологических оболочек, страница 8

Рис.12а. Поверхность диафрагмаль-ной плевры человека. Отверстия в базальной мембране над «люками» (1,2,3). Эпителий удален мацерацией и промывкой. Импрегн-ация соединительной ткани для отраженной микроскопии. Отра-женная микроскопия в «темном поле зрения» при кольцевом косопадающем освещении. Эпиобъектив 25. Окуляр 12,5.

Рис. 12с.  Препарат и микро-скоп те же, эпиобъектив 50. Трабекулы образованы кон-центрацией волокон поверх-ностного коллагенового слоя в пучки (4) с крупной вол-нистостью, определяющей размеры ячеек. Над трабеку- лами расположена базальная мембрана, в которой могут быть отверстия –окна (1,2,3)

Рис. 12в.   Препарат и его участок, микроскоп  и его оптика («Вертивал», К.Цейсс), те же, что и на рис. 11а. Микроскопия на просвет. Над тканевыми щелями в глубоких слоях плевры – «люками» перекинуты  трабекулы. Размеры ячеек трабекул значительно больше размеров отверстий «люков» (1,2,3)

 

О микроскопии незаключенных препаратов.

Изучение свободной (люминальной) поверхности естественных оболочек является одним из наиболее информативных методов их исследования. Очевидно, что их внутреннее строение находит какое-то отражение на поверхности, и в целом, внутренние структуры чаще всего ориентированы на обслуживание поверхности. Микроскопия пленочных  препаратов позволяет легко изучить значительные площади естественных оболочек. В этом плане представляет особую ценность микроскопия незаключенных препаратов. Так, размеры готовых для микроскопии препаратов не лимитированы размерами покровных стекол, и даже не размерами предметных стекол. Линейные параметры перемещения препаратоводителей позволяют микроскопировать препараты брюшины, плевры размерами 8х5 см (обычные столики микроскопов К. Цейсс), то есть несколько больше чем площадь 2-х уложенных рядом предметных стекол. Подобного размера хорошего качества предметные стекла можно получить разрезав пополам стандартную фотопластину толщиной 1,5 мм.

Забор материала. Толщина, как и ее равномерность, пленочного препарата для отраженной микроскопии не имеет большого значения. Легко снимаемые пленки можно было бы и отдирать (к примеру, чтобы получить косвенные данные о биомеханических свойствах сцепленности отдельных пластов пленок, рис. 13). Но при этом на отсепарованной поверхности образуется много вышедших из тканевой системы волокон, которые импрегнируются очень интенсивно (как демаскированнные волокна), что мешает в случае микроскопии на просвет. Для отраженной микроскопии структур отсепарованной поверхности пленок (обратной стороны пленок), чтобы избежать значительной дезорганизации тканей, пленки надо отделять пользуясь острым лезвием. При этом желательно брать пленки с участками несколько разной толщины, что позволит микроскопировать структуры лежащие на разной глубине от поверхности.

Рис. 13. Висцеральная плевра человека, внутренняя сторона пленочного препарата, отделенного механическим путем. Импрегнация соединительной ткани для отраженной микроскопии. Среди дезорганизованных волокнистых структур сохрани-лось хорошо армированное ложе венулы диаметром около 60 мкм. Коллагеновые волокна диаметром около 5 мкм окружают сосуд перпендикулярно его оси примерно на полдиаметра и вплетаются в окружающую ткань (1). Они, в отличие от обычных волокон, лишены видимой извилистости (кривизна извилистости ориентирована  по окружности сосуда) и способны предотвратить расширение венулы во время вдоха.  Отраженная микроскопия в «темном поле зрения» при кольцевом косопадающем освещении. Эпиобъектив 12. Окуляр 12,5.

 

1

Микроскопия поверхности требует очень тщательного расправления пленочного препарата на предметном стекле. Этого можно легче достичь на незаключенном препарате. После просмотра его под микроскопом приходится многократно подправлять укладку препарата. Искусственные складки, валики затрудняют микроскопию, вносят искажения. Незаключенный препарат можно микроскопировать с двух сторон, многократно переворачивая его на предметном стекле. В случае надобности, его можно дополнительно импрегнировать. Кроме того, на незаключенном препарате можно проводить дополнительные манипуляции, к примеру, отслоить базальную мембрану (рис.11), отворачивать покровные мембраны для микроскопии их «изнутри» - снизу, со стороны полости (рис ), раскрывать (рис) тканевые щели микроинструментами (иголками).

     

 

Брюшина, отраженная микроскопия, микроскоп Вертивал, об. 25, ок 12,5. Микропрепарка, удалены и частично отведена базальная мембрана, вскрыта полость в толще брюшины.

 

  

Можно воспользоваться импрегнацией по Бильшовскому в модификации Гросс -Шультце, изменив ее для выявления соединительной ткани.

·  Предварительная подготовка материала как обычно:

·   

. Исключить? золочение и восстановление после него в 1-3% растворе Фиксация пленочного препарата как обычно, или одни сутки в 20% формалине в термостате при температуре 38 град. С. (или 3 часа при 56 град. С.) с последующей промывкой дистиллированной водой 5 мин.

-  Сенсибилизация в 10% растворе азотнокислого серебра надестиллированной воде.

-  Экспозиция в 10% формалине.

-  Удаление избытка раствора формалина фильтровальной бумагой.

-  Экспозиция в разведенном в 5 раз стандартно приготовленном растворе аммиачного серебра до черного или пепельно-черного цвета (вместо коричневого цвета по оригинальной методике) препарата. При этом впитавшийся в препарат формалин проявляет (восстанавливает) серебро в клетках, межклеточном веществе и на поверхности препарата.

-  Далее как обычно: остановка проявления в аммиачной воде, промывание в дестиллированной воде, удаление невосстановленного серебра в фиксаже (5% раствор гипосульфита) 1 минуту, промывка, обезвоживание и заключение в бальзам. Можно микроскопировать расправленный незаключенный препарат в отраженном свете после последней промывки.