Отраженная трехмерная световая микроскопия поверхности биологических оболочек, страница 4

• Интересующие, хорошо прокрашенные (очерненные) участки естественных оболочек отсепаровываются, расправляются на препаровальной доске и стереомикроскопируются погруженными в водяную ванночку. Микроскопическая картина представляет собой желто-коричневую или черно-белую картину рельефа поверхности препарата, если импрегнирование проводилось раствором серебра на дистиллированной воде. При импрегнации препарата раствором серебра на осажденной водопроводной воде микроскопическая картина получается более красочной – бело-желто-розово-зелено-синей (Рис.8). Подобные цвета исследуемой поверхности при отраженной световой микроскопии обусловлены не структурой ткани, а условиями восстановления импрегнированного серебра. В труднодоступных для освещения затемненных местах ткани обычно прокрашиваются  меньше и имеют желто-розовый оттенок цвета. Очевидно, эти цвета обусловлены интерференцией света на импрегнированных структурах.
• Удаление невосстановленного серебра в фиксаже (5% раствор гипосульфита) 1 минуту, промывка, фиксация  в формалине.
• Полученные пленки можно обработать для обычной светооптической микроскопии: обезвоживание, просветление и заключение в бальзам.

Рис. 8.   Поверхность парапателлярной зоны синовиальной мембраны коленного сустава человека, импрегнированная азотнокислым серебром. Подпокровные жировые дольки и складки отделены бороздами. Тотальный препарат помещен в водяной ванне, одностороннее падающее освещение со стороны верхней кромки рисунка переносным источником света. Отраженная микроскопия через МБС-9, фотокамера на одном окуляре. Увеличение 4 х 12,5.

 

     

3.2.  Гистологический уровень исследований.

Полученные вышеописанным способом пленки можно расправить на предметном стекле, смочить водой и исследовать в микроскопах плоского поля зрения в проходящем и падающем освещении без покровного стекла (эпиобъективы обычно рассчитаны для работы без покровного стекла). Для более продолжительной микроскопии незаключенных препаратов, их, после подсыхания, лучше смочить глицерином – препараты не высыхают долго.

При отраженной микроскопии заключенных препаратов чистота покровного стекла имеет большее значение, чем при микроскопии на просвет. На нем на должно быть бликообразующих натеков бальзама и пыли.

Для отраженной микроскопии толщина пленки не имеет большого значения. Это позволяет исследовать участки естественных оболочек, где трудно или невозможно снимать тонкие прозрачные пленки. В свою очередь, тонкие пленки можно микроскопировать и в отраженном свете и на просвет.

Препараты для отраженной микроскопии следует (можно) готовить для двух целей.

1.  Исследование рельефа поверхности пленок как границы раздела сред.

2.  Исследование тканевой организации поверхности пленочных препаратов.

3.2.1. Для достижения первой цели – изготовление пленочного препарата для исследования рельефа свободной его поверхности – можно воспользоваться двумя способами серебрения: Они предназначены для осаждения серебра из раствора на поверхность препарата, подобно покрытию серебряным зеркалом (подобно напылению для растровой электронной микроскопии).

3.2.1.1. Фиксированные в 10% растворе формалина препараты без промывки, чтобы не удалять формалин с поверхности и из поверхностных структур препарата, удалив избыток раствора формалина фильтровальной бумагой, поместить в раствор аммиачного серебра. Приготовленный по прописи Бильшовского аммиачный раствор серебра следует развести в 5 раз (прибавляем дистиллированную воду до 100 мл, вместо 20 мл) во избежание избыточного отложения серебра на поверхности и в толще препарата. В случае серебрения больших размеров пленочных препаратов при появлении почернения раствора, препарат переносится во вторую чашку. Препараты приобретают пепельный или пепельно-черный цвет, в зависимости от клеточного или волокнистого строения поверхности. Некоторая недоимпрегнация пленок большой толщины, до коричнево-черного цвета, позволяет идентифицировать структуры поверхности на просвет. В свою очередь, недостаточно серебренные пленочные препараты, после контрольной микроскопии, можно импрегнировать еще раз.

Далее тщательное промывание в 3-4 порциях дестиллированной воды для удаления микроскопических частичек металлического серебра из глубины борозд поверхности препарата, удаление невосстановленного серебра в фиксаже (5% раствор гипосульфита) 1 минуту, промывка, обезвоживание и заключение в бальзам. Можно микроскопировать и незаключенный расправленный на предметном стекле препарат (Рис.9) в отраженном свете после первой промывки.

Рис. 9.                Поверхность базальной мембраны диафрагмальной плевры человека. Эпителиальные клетки удалены мацерацией и промыванием. Серебрение поверхности, не заключенный расправленный пленочный препарат. Отверстия «люков» расположены рядами (1) в пониженных участках рельефа поверхности (над ямками). Отраженная микроскопия в «темном поле зрения» через «Вертивал» (К.Цейсс) при одностороннем косопадающем освещении со стороны левой кромки рисунка. Эпиобъектив 25. Окуляр 12,5.

 

1

3.2.1.2. Нефиксированные препараты (или тотальные объекты с неотсепарованными оболочками) можно серебрить следующим образом: помещаем их в стандартно приготовленный раствор аммиачного серебра на 5-10 минут, в этот же раствор приливаем каплями 10% формалин. За несколько минут препарат чернеет – серебро восстанавливается до металлического состояния в препарате и на его поверхности. Как и в предыдущем 3.2.1.1. способе не проводится сенсибилизация на избирательное выявление отдельных структур, а импрегнируются все аргентофильные структуры.