Отраженная трехмерная световая микроскопия поверхности биологических оболочек, страница 5

Промывка в нескольких порциях дистиллированной воды. Далее можно расправить и микроскопировать в отраженном свете незаключенный препарат, или более тщательно обработать как в предыдущем варианте: удаление невосстановленного серебра в фиксаже (5% раствор гипосульфита) 1 минуту, промывка, фиксация  в формалине, обезвоживание и заключение в бальзам. Рисунок 10а и 10в одного и того же участка серебрённого препарата без перефокусировки микроскопа представлены для демонстрации эффектов кольцевого и одностороннего косопадающего методов освещения в «темном поле зрения».

2

1

1

1

1

 

	Рис.10а. Поверхность базальной мембраны диафрагмальной плевры человека. Эпители-альные клетки удалены мацерацией и промыванием. Серебрение поверхности, не заключенный расправленный пленочный препарат. 1 – отверстия щелевидных люков. Отраженная микроскопия в «темном поле зрения» через «Вертивал» (К.Цейсс) при кольцевом косопадающем освещении. Эпиобъектив 12. Окуляр 12,5.		Рис 10б. Препарат и его участок те же, что на рис 10а. 1 – отверстия щелевидных люков. 2 – волнистость рельефа поверхности (направление коллагеновых волокон поверхностной волокнистой сети перпендикулярно фронту волнистости). Отраженная микроскопия в «темном поле зрения» через «Вертивал» (К.Цейсс) при одностороннем косопадающем освещении со стороны левой кромки рисунка. Эпиобъектив 12. Окуляр 12,5.

 

3.2.1.3. Модификации обычных методов импрегнации для того, чтобы во время изготовления классических (на просвет) импрегнированных серебром препаратов, по желанию, часть препаратов изготавливать для отраженной микроскопии. То есть импрегнацию клеточных и (или) межклеточных структур сочетать с дополнительным осаждением серебра на поверхность препарата. Для этого следует исключить промывку на этапах импрегнации для сохранения импрегнированного в аммиачном растворе ионов серебра или восстанавливающего формалина в поверхностных структурах и на поверхности препарата. При классической импрегнации просветляющей промывкой удаляют часть реагентов с поверхностных структур (с двух сторон препарата) для того, чтобы эти структуры не затемняли поле зрения или не заслоняли глубже лежащие структуры. Это особенно важно для пленочных препаратов, имеющих значительную толщину, так как за время экспозиции, необходимой для проникновения реагентов вглубь, поверхностные структуры окажутся переимпрегнированными.

Можно также порекомендовать дополнительное серебрение поверхности отдельных неудачно импрегнированных (на выявление кровеносных сосудов, нервов и др.) препаратов для микроскопии их поверхности в отраженном свете способом  3.2.1.2 , то есть - экспозиция препарата в формалине и далее в аммиачное серебро, или наоборот.

3.2.2. Изготовление препарата для отраженной микроскопии поверхностно расположенных соединительнотканных элементов, участвующих в формировании  поверхности.

Импрегнация, в отличие от напыления, пропитывает структуры в толще препарата. Это позволяет использовать проникающую способность падающего света и микроскопировать в отраженном свете покровные и подпокровные структуры, лежащие на небольшой глубине от поверхности препарата. Для этого необходимо, с одной стороны, избежать осаждения серебра на свободной поверхности препарата (А), а с другой –  добиться импрегнации покровных и подпокровных структур (В).

А - избежать осаждения серебра на поверхность препарата из окружающего раствора можно несколькими способами:

-  Заключительный этап - восстановление импрегнированного в аммиачном растворе серебра, проводить в растворе формалина, то есть сначала пропитать препарат серебром и потом проявлять его в растворе формалина, а не наоборот.

-  Избегать почернения  растворов, перекладыванием препарата в новые чашки со свежим раствором, чтобы восстановленное в растворе серебро не осаждалось на поверхности препарата.

-  Удалять избыток импрегнирующего аммиачного серебра, переходящего в окружающий раствор, фильтровальной бумагой, что является более бережным способом удаления, по сравнению с проникающим смывом.

-   «Спрятать» поверхность пленочного препарата формированием его дупликатуры исследуемыми поверхностями друг к другу фиксацией пластмассовой скрепкой.

В - для того чтобы добиться полноценной импрегнации покровных и подпокровных структур необходимо исключить на заключительных этапах импрегнации промывание (споласкивание) препаратов.  В свою очередь, отметим, что смывающее полоскание препаратов на заключительных этапах импрегнации является одной из причин непригодности препаратов, импрегнированных традиционно, для отраженной микроскопии поверхности.

Напомним, что промывания включены как обязательные этапы в классических методах импрегнации соединительной ткани, ее сосудов и нервов в глубине препарата, для того, чтобы поверхностно лежащие клетки (в особенности, эпителиальные клетки) не забивали  поле зрения при просвечивающей микроскопии.

Сначала, для сравнения, приведем классические способы импрегнации соединительной ткани  замороженных срезов из фиксированного формалином материала.

 По Бильшовскому  (Б.Ромейс,1953).

·  Промытые в дистиллированной воде срезы помещают в 2% раствор азотнокислого серебра на 24 часа.

·  Споласкивание в двух стаканчиках дистиллированной воды 3-5 секунд.

·  Экспозиция 5-10 минут в растворе аммиачного серебра.

·  Промывка в двух стаканчиках дистиллированной воды, 5-10 секунд.

·  Экспозиция в 10% формалине на водопроводной воде 5 минут.

·  Промывка обычной водой, 15 минут.

·  Золочение в слабом растворе хлорного золота (3-5 капель 1% раствора на 10 мл дистиллированной воды).