Отраженная трехмерная световая микроскопия поверхности биологических оболочек, страница 6

·  Фиксация в 5% гипосульфите, 30 секунд

·  Промывка 0,5-2 часа в воде, обезвоживание, ксилол, бальзам.

Приготовление аммиачного раствора серебра:  10 мл 10% азотнокислого серебра + 5 капель 40% едкий натр + аммиак капельно до растворения осадка при постоянном взбалтывании + дестиллированную воду до 20 мл общего объема. Полученное для импрегнации серебро в растворе находится в виде аммиачной окиси и аммиачного нитрата.

Надежность метода существенно увеличивается после предварительной обработки препарата по Пердроу (1921): 3 минуты в 0,25% растворе перманганата калия, ополаскивание дистиллированной водой, 1% раствор щавелевой кислоты – 5 минут, промывка в 5-6 порциях дистиллированной воды в течение 1 часа.

Метод импрегнации по Бильшовскому нервной ткани (Б.Ромейс, 1953) принципиально не отличается от приведенного метода импрегнации по Бильшовскому соединительной ткани. Отличия касаются только: более длительной экспозиции в аммиачном растворе серебра (10-20 минут), большей экспозиции (10 минут) и концентрации восстанавливающего формалина (20%). То есть импрегнация по Бильшовскому выявляет и соединительную и нервную ткани. Для избирательного выявления нервных структур Бильшовский проводит предварительную обработку препарата пиридином, подавляющим импрегнацию соединительной ткани.

По Бильшовскому в модификации Гомори  (Б.Ромейс, 1953), не требующей больших затрат времени.

·  Предварительная обработка. 1-2 минуты в 0,5-1% растворе перманганата калия, промывка обычной водой, 5 минут, 1-3% раствор метабисульфита калия, 1 минута, промывка в обычной воде, 5-10 минут.

·  Сенсибилизация в 10% растворе азотнокислого серебра, 2 минуты.

·  Промывка в двух порциях дистиллированной воды по 2 минуты.

·  Импрегнация в аммиачном растворе серебра, 1 минута.

·  Быстрое споласкивание дистиллированной водой, 5-10 секунд. При очень кратком споласкивании импрегнация становится слишком густой, при слишком продолжительном – неполной.

·  Восстановление в 10% формалине на обычной воде.

·  Далее промывка, вираж в 0,1-0,2% растворе хлорного золота 10 минут, споласкивание, 1-2% раствор метабисульфита калия (1 минута), фиксаж в 1% растворе гипосульфита (1 минута), основательное промывание, обезвоживание, ксилол, бальзам.

Приготовление аммиачного раствора серебра:  10 мл 10% азотнокислого серебра + 2 мл 10% едкого калия + крепкий аммиак капельно до растворения осадка при постоянном взбалтывании + 10% растворе азотнокислого серебра капельно до тех пор, пока появляющийся осадок не начнет исчезать при встряхивании лишь с трудом + дистиллированную воду до удвоения общего объема. Полученный раствор может сохраниться 2 дня в коричневой хорошо закрытой склянке.

Для данных способов характерны: последовательность этапов: сенсибилизация азотнокислым серебром,   импрегнация серебра в виде аммиачного его раствора,  восстановление серебра формалином; приготовление аммиачного серебра с использованием щелочи; частичное удаление серебра с поверхности препарата промывкой   после аммиачного раствора.

Рассмотрим также способ Бильшовского в модификации Гросс-Шультце  (Б.Ромейс,1953) для выявления нервной ткани.

·  Промытые в дистиллированной воде срезы помещают в 20% раствор азотнокислого серебра не меньше чем на 1 час в темноте.

·  Экспозиция препаратов поодиночке в 20% формалине при непрерывном движении в 4-6 чашках на обычной воде 4-7 минут. При появлении белого облачка препарат переносят во вторую чашку и т.д.

·  Импрегнация в аммиачном растворе серебра при наблюдении под малым увеличением микроскопа.

Приготовление аммиачного раствора серебра: к 5-10 мл 20% раствора азотнокислого серебра прибавляют при непрерывном встряхивании по каплям 25% раствор аммиака до тех пор, пока исчезнет коричневый осадок.

Импрегнацию проводят в часовом стекле в 4-5 мл аммиачном растворе серебра, к каждому 1 мл которого прибавляют по 1 капле аммиака. Если происходит интенсивное окрашивание соединительной ткани и ядер, то следующий срез импрегнируют в растворе с несколько большим содержанием аммиака (например, 3 капли на 2 мл); так поступают до тех пор, пока не будут окрашиваться лишь нервные волокна.

·  Остановка импрегнации в аммиачной воде (к 8 мл дистиллированной воды прибавляют 7 мл аммиака), 1 минута.

·  Быстрая промывка в дистиллированной воде, золочение и т.д.

Данная модификация рассчитана на избирательное выявление нервной системы. Оно достигается дозированным подавлением импрегнации серебром клеток и волокон соединительной ткани. Для этого производится передозировка аммиака в аммиачном растворе серебра. То есть, вместо неустойчивого раствора, из которого серебро легко осаждается на аргентофильных структурах, готовится раствор, из которого серебро не выпадает легко в осадок. Для пояснения вернемся к способу приготовления аммиачного раствора серебра: в раствор азотнокислого серебра добавляется аммиак, серебро в виде окислов выпадает в осадок, при дальнейшем добавлении аммиак начинает растворять этот осадок. Аммиак добавляют ровно столько, чтобы растворить последние крупинки осадка, не больше. При этом раствор находится в неустойчивом равновесии: незначительное удаление аммиака (при испарении) или снижение щелочности раствора приводит к выпадению осадка из раствора, и наоборот, незначительный избыток аммиака переводит раствор в устойчивое состояние.

Отметим, что передозировка аммиака не допускается при растворении осадка серебра аммиаком при применении способа Бильшовского для выявления соединительной ткани. Даже возможная передозировка аммиака нивелируется обратным титрованием аммиачного раствора серебра азотнокислым серебром в модификации способа Бильшовского по Гомори.

В целом, способ по Гросс-Шульце характеризуется: иной последовательностью этапов импрегнации: сенсибилизация азотнокислым серебром – формалин - аммиачное серебро; приготовлением аммиачного серебра без использования щелочи; подавлением импрегнации (соединительной ткани) передозировкой аммиака. Подавление импрегнации клеток и межклеточного вещества соединительной ткани делает ненужным частичное смывание реагентов с поверхностных структур препарата (просветление) полосканием на заключительных этапах импрегнации.