освещение (Рис.7; 10б).. Для плавного, регулируемого перехода на одностороннее освещение достаточно перекрыть с одной стороны часть светового потока между лампой и объективом непрозрачной шторкой в гнезде для светофильтров (можно смещением в сторону полевой диафрагмы, смещением угла наклона кольцевого поворотного зеркала и др.). Эпиобъективы фирмы ЛОМО, и, в особенности, фирмы К.Цейсс (6,3; 12,5; 25; 50) обладают довольно большим фокусным расстоянием, что позволяет микроскопировать препараты со значительными перепадами уровней рельефа. В микроскопах последних поколений выпуска фирмы К. Цейсс применяются новые эпиобъективы – эпипланахроматы и эпипланапохроматы с большим рабочим расстоянием для освещения методами светлого и темного поля. Чрезвычайно ценно, что эпиобъективы фирмы К.Цейсс, оснащенные мощной, легко регулируемой эписистемой освещения, позволяют исследовать при небольших увеличениях (до 300 раз) интересующие участки препарата в отраженном свете с обеих сторон - и через покровное, и через предметное стекла. Если для микротомных срезов ориентация перед заключением почти не имеет значения, то для отраженной микроскопии пленочных препаратов естественных оболочек она имеет первостепенное значение – покровные структуры должны быть обращены к объективу, к покровному стеклу. То есть, оболочки, являясь структурно ориентированными образованиями, должны быть ориентированными и на предметном стекле. Покровный слой пленок обычно выглядит более гладко и с более выраженным серебристым металлическим отливом. Для выяснения внутритканевых взаимоотношений структур поверхности препарата, покровных и подпокровных структур, очень полезной может быть отраженная микроскопия препарата с обратной стороны. Для этого концы перевернутого покровного стекла с заключенными или с расправленными влажными незаключенными препаратами кладутся не в захваты, а на захваты препаратоводителя микроскопа.
3. Подготовка биологических объектов и изготовление гистологических препаратов для отраженной световой микроскопии.
3.1. Макро-микроскопический (анатомический) уровень исследований.
Подготовительным этапом макро-микроскопических исследований биологических объектов является препаровка его под стереомикроскопом при освещении переносным источником света (одностороннее косопадающее освещение). Обычно, основной проблемой такой макро-микропрепаровки является слабая дифференцировка исследуемых тканей. Для лучшей визуализации препарируемых структур мы применяем тотальную импрегнацию серебром целого объекта, к примеру, вскрытый сустав с удаленными окружающими тканями или его фрагмент, участки диафрагмы размерами 10х10 см, содержимое глазницы с веками и разрезанным глазным яблоком и т.п. Импрегнацию проводим двумя способами: на клетки и межклеточное вещество аммиачным раствором серебра; или на межклеточную ткань – азотнокислым серебром. Последний способ может быть использован, в частности, для окраски оболочек с многослойным эпителием, чтобы толстый эпителий не заслонял подпокровные структуры, в случае микроскопии, изготовленного в последующем, препарата на просвет.
3.1.1. Импрегнация клеток и межклеточного вещества тотальных препаратов аммиачным раствором серебра для отраженной макро-микроскопии и препаровки.
· Отмытые в проточной воде нефиксированные объекты помещаем в аммиачный раствор серебра на 30 минут в темном месте. Этого времени достаточно для пропитывания раствором серебра до 1 мм естественных и искусственных поверхностей препарата, поверхностей разрезов. Раствор должен покрывать объект и быть не меньше, чем объем тканей.
Раствор готовим следующим образом: К 10 мл 10% раствора азотнокислого серебра прибавить 2 мл 10% едкого калия. Осадок растворить крепким (25-28%) аммиаком, взбалтывая после каждой капли. Прибавить каплю за каплей 10% раствор азотнокислого серебра (обратное титрование, для более точного уменьшения аммиака в растворе) пока появляющийся осадок не начнет исчезать при встряхивании с трудом. Прилить дистиллированную воду до 100 мл.
· В раствор с объектом каплями прибавляем (до почернения объекта) 10% формалин на дистиллированной воде для восстановления серебра в тканях поверхностных и глубь лежащих структур, и для дополнительного осаждения восстановленного в растворе серебра на исследуемых и других поверхностях.
· Промывка обычной водой, исследование и изготовление (отсепаровывание) импрегнированных пленочных препаратов с интересующих участков под стереомикроскопом.
3.1.2. Импрегнация клеточных границ и межклеточного вещества тотальных препаратов раствором азотнокислого серебра для отраженной макро-микроскопии и препаровки.
· Отмытые в проточной воде нефиксированные объекты помещаем в 0,5 – 1 % раствор азотнокислого серебра в стеклянной посуде в хорошо освещенном месте на несколько суток, до приобретения им черного цвета. При этом импрегнированное в ткани серебро восстанавливается в межклеточном веществе до металлического состояния под воздействием солнечных лучей. В случае необходимости куски тканей можно сразу же начать препарировать и микроскопировать, импрегнируя их серебром сходу – облучение источником света смачивающего 1-5% раствора серебра вызывает быстрое его восстановление в импрегнированных тканях. Импрегнированные только с одной стороны, орошением и освещением со стороны свободной поверхности, и отсепарованные после покраски, пленочные препараты могут быть значительной толщины – они лучше пропускают свет и при трансмиссионной микроскопии. Это может быть полезно при исследовании трудно отделяемых участков оболочек, к примеру, адипозного и фиброзного типа участков синовиальной мембраны суставов.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.