Способ светооптического микроскопического исследования поверхности незаключенных пленочных препаратов биологических оболочек (Способ исследования поверхности биологических оболочек)

Способ светооптического микроскопического исследования поверхности незаключенных пленочных препаратов биологических оболочек.

(Способ исследования поверхности биологических оболочек)

Способ относится к биологии и медицине, а именно к методам гистологических исследований оболочек с естественной поверхностью, таких как брюшина, плевра, синовиальная мембрана, кожа и др. с помощью светооптических микроскопов.

Традиционная светооптическая микроскопия гистологических препаратов на просвет проводится в двумерном изображении и не дает объемной картины поверхности биологических оболочек.

 на, не дает картины проводится на окрашенных, обезвоженных, просветленных и заключенных в бальзам гистологических препаратах срезов или отсепарированных тонких пленок,.

Трехмерная светооптическая микроскопия поверхности биологических оболочек, дающая объемное изображение рельефа поверхности проводится на серебрённых и, в последующем, обезвоженных, просветленных и заключенных в бальзам, пленочных препаратах, микроскопией их в одностороннем косом падающем отраженном свете (1). Данный способ взят нами за прототип.

Микроскопию поверхности биологических оболочек в отраженном свете можно проводить, в отличие от прототипа, на влажных пленочных препаратах без заключения их в бальзам между предметным и покровным стеклами.

Целью изобретения является снижение трудоемкости, повышение качества и информативности светооптической микроскопии структур рельефа поверхности пленочных препаратов.

Цель достигается микроскопией в одностороннем косом падающем отраженном свете поверхности предварительно серебрённых естественных оболочек на незаключенных влажных пленочных препаратах.

Предложенный способ основан на том, что при микроскопии поверхности серебренного препарата в отраженном свете исследуется строение самой поверхности как таковой. При этом нет надобности замещения воды в толще препарата на прозрачные наполнители – бальзамы, c предшествующими ему процедурами обезвоживания и просветления, увеличивающими прозрачность препарата в целом для светооптической микроскопии на просвет. В свою очередь, вода, увлажняющая поверхности препарата, является прозрачной средой (более прозрачной чем бальзамы), обеспечивающей хорошие условия микроскопии поверхности влажного препарата в падающем отраженном свете. Исключение процедуры заключения препарата между предметным и покровным стеклами не только экономит время на изготовление препаратов, но и открывает дополнительные возможности при их исследовании: В первую очередь, это возможность изготовления и микроскопии препаратов большой площади. Размеры готовых для микроскопии влажных препаратов не лимитируются размерами стандартных покровного и предметного стекол. Они определяются линейными параметрами перемещения стандартных препаратоводителей столика микроскопа – 8х5 см, что на порядок выше площади обычно заключаемых препаратов (подобного размера хорошего качества предметные стекла для расправления и размещения влажного препарата получаются из очищенной фотопластинки толщиной 1,5 мм).  Во-вторых, микроскопия незаключенных и не пропитанных бальзамом влажных препаратов дает возможность дальнейших манипуляций с изготовленным препаратом во время его исследования, для получения дополнительной информации, повышения ее достоверности. Так, становятся возможными визуализация динамики структурных изменений в препарате при его деформировании на столике микроскопа, визуализация динамики выхода воды на поверхность препарата, распространения водорастворимых красителей по препарату. Становятся возможными механическое расширение естественных борозд для изучения структур их дна, более качественного расправления искусственных борозд и возвышений, выявляемых во время микроскопии, отведения от интересующей зоны поверхности реактивных структур – ворсин, отворачивания последних и  визуализации структур зон их прикрепления. Это и возможность полного переворачивания препарата для микроскопии обратной его стороны. Так можно уточнить строение глубоких волокнистых слоев, глубину проникновения  полостей («люков» брюшины) под конкретными порами на поверхности препарата и др.

микроскопия незаключенных и не пропитанных бальзамом влажных препаратов

Для микроскопии поверхности незаключенных влажных препаратов в отраженном свете, препарат необходимо обезжиривать, с целью получения на его поверхности тонкого равномерного смачивающего слоя воды. Необезжиренная поверхность плохо смачивается водой, что приводит к бликообразованию на границе неувлажненных участков поверхности, к искажению изображения в линзах нерастекающихся капелек воды. Обезжиривание обрабатываемых пленок спиртом проводится перед процедурой его серебрения, что, в свою очередь, улучшает условия проникновения в препарат водных растворов азотнокислого серебра и его восстановителей.

Для исследования в отраженном свете, препарату придается светоотражательная способность  внедрением (импрегнацией) в него серебра в виде азотнокислого раствора и последующим восстановлением его в толще и на поверхности препарата в металлическое светоотражающее состояние, по методике прототипа.

Расправленный на предметном стекле незаключенный влажный препарат микроскопируется в отраженном свете при одностороннем падающем тенеобразующем освещении (прототип, фиг. 1). В отличие от прототипа, для микроскопии незаключенных препаратов необходимо применять объективы, рассчитанные для работы без покровного стекла – объективы «металлографических» (по Егоровой О.В. -С микроскопом на «ты». СПб. 2000, с. 42) микроскопов. Подобными объективами с эпи-системой освещения (Фиг. 2 и 3) оснащены микроскопы падающего света, реализующие отраженную световую микроскопию впадающем свете в темном поле зрения. Для получения одностороннего падающего тенеобразующего освещения необходимо преобразовать круговое (бестеневое) косое падающее освещение (Фиг.2) данных микроскопов в одностороннее (тенеобразующее) косое падающее освещение (Фиг.3). Для этого перекрывается с одной стороны половина светового потока осветителя до поворотного зеркала перед эпиобъективом непрозрачной шторкой (к примеру, боковым смещением ползунка-держателя светофильтров в гнезде для введения в световой поток сменных светофильтров).

					Фиг. 2. Штатное  бестеневое освещение объекта (2) круговым (4) косым падающим светом  в темном поле зрения через эпиобъектив микроскопа падающего света.
	Фиг. 1- прототип. 1 – объектив микроскопа плоского поля 2 -заключенный объект и его  тень 3–тенеобразующий  одно-сторонний косой падающий свет от переносного источника света .								Фиг. 3. Тенеобразующее освещение объекта (2) односторонним (5) косым падающим светом  в темном поле зрения через эпиобъектив микроскопа падающего света.  6- шторка, перекрывающая половину светового потока.

          Импрегнированные серебром незаключенные пленочные препараты хранятся в дистиллированной воде в стеклянной склянке с плотно закрываемой крышкой в неосвещенном месте неограниченное время. При необходимости, они достаются из воды, расправляются на предметном стекле, микроскопируются и повторно опускаются в эту же склянку. Многократная повторная микроскопия препаратов (в нестерильных условиях) не выявили в них признаков изменения импрегнации, инфицирования воды и препаратов. Посевы воды из склянок на питательные среды не дают рост микробных колоний. Содержащиеся в препаратах серебро предотвращает инфицирование самих препаратов и среды их хранения. Для предотвращения замерзания воды при хранении и транспортировке препаратов в склянку с водой добавляется спирт до 40-50%.