Условия получения клеток-фагоцитов: Можно использовать гепаринизированную венозную или капиллярную кровь, но удобнее работать с лейкоцитарной взвесью.
Выбор объекта фагоцитоза: В качестве тест-объекта для изучения фагоцитоза могут использоваться как суспензия микроорганизмов (Staphylococcus aureus или Е. coli) так и частицы латекса диаметром 3 мкм. В последнем случае недостатком является невозможность определения параметров завершенности фагоцитоза (т.е. уничтожения и деструкции объекта фагоцитоза).
Условия приготовления объекта фагоцитоза: Со скошенного питательного агара с суточной культуры S.aureus или Е. coli физиологическим раствором смывают колонии микробов. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов связаны с концентрацией объекта фагоцитоза, т.е. с концентрацией микробной суспензии или суспензии частиц латекса, поэтому для стандартизации проводимых исследований нужно использовать одинаковую концентрацию объектов фагоцитоза. Как правило, соотношение нейтрофилы : микробы должно составлять 1 : 100. Доведение суспензии микробов до необходимой (1´109/мл) концентрации проводят с помощью оптического стандарта мутности.
Стандарт мутности представляет собой ампулированный препарат, содержащий суспензию инертных частиц диаметром 1 – 2 мкм в определенной концентрации (выпускаются стандарты мутности на 1´106 частиц в мл, 1´109 частиц в мл и др.). При доведении концентрации микробной суспензии до желаемого уровня проводят визуальное сравнение мутности стандарта с суспензией микробов, помещенных в пробирку такого же диаметра, что и ампула стандарта мутности. При видимом превышении концентрации микробной суспензии ее разводят физиологическим раствором. Основным недостатком данного подхода является субъективность учета, поэтому более приемлемым вариантом является автоматизированное определение концентрации микробной суспензии с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК).
Иногда, в связи с вирулентностью микроорганизмов, их подвергают формалинизации. Для этого суспензию микроорганизмов смешивают с равным объемом формалина, инкубируют в течении 5 минут, затем отмывают 3 раза и доводят до необходимой концентрации.
Условия проведения реакции: В пробирке смешивают в равных объемах (100 мкл +100 мкл или 50 мкл + 50 мкл) микробную и лейкоцитарную взвеси (или гепаринизированную кровь), перемешивают и инкубируют при 37° С 30 мин (это время необходимо для миграции нейтрофилов, адгезии микробов на их цитоплазматической мембране и собственно фагоцитоза), затем центрифугируют (5 мин, 1500 об/мин.) и из осадка готовят мазки. Мазки высушивают, фиксируют этанолом 15 мин., окрашивают по Романовскому-Гимзе 20-30 мин.(рН 7,2 - 7,4), ополаскивают в проточной воде и микроскопируют.
Регистрация результатов: Учет результатов проводится под иммерсионной системой микроскопа с увеличением 10´90. Микробы окрашены в темно-фиолетовый (или темно-синий) цвет, хорошо контурируются. Среди 100 - 200 нейтрофилов подсчитывают число фагоцитирующих клеток и общее число поглощенных микробов.
Показатели активности фагоцитоза:
1. ФП- процент фагоцитирующих нейтрофилов - процент клеток, вступивших в фагоцитоз от общего их количества,
ФП=(число фагоцитов/число всех нейтрофилов)´100 %. Например, среди 100 нейтрофилов фагоцитируют микробы 64 клетки, значит ФП = (64/200) )´100 % = 32 %.
2. ФЧ - фагоцитарное число, среднее число поглощенных микробов - частное от деления общего количества поглощенных микробов на процент фагоцитоза. Например, 64 нейтрофила-фагоцита фагоцитировали 214 бактерий, тогда ФЧ= 214/64 = 3,34
Нормальные показатели фагоцитоза при использовании суспензии стафилококка: ФП - 45-75; ФЧ – 4,5 – 7,5.
94.Методы исследования системы комплемента.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.