Выделение почвенных нефтедеструкторов и их идентификация

Министерство образования и науки Российской федерации

Новосибирский государственный университет

Факультет естественных наук

Кафедра молекулярной биологии

Отчетная работа по микробиологии

Выделение почвенных нефтедеструкторов и их идентификация

                                                                      Выполнила: Баблюк Екатерина, гр. 8405

Научный руководитель: к.б.н. Ильичёва    

                                                                                                                      Татьяна Николаевна

Новосибирск 2011

Введение

Нефть и нефтепродукты относятся к наиболее распространенным загрязнителям биосферы. Проблема очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений приобретает все большую остроту в связи с ограниченностью возможностей (а иногда и экологического вреда) применения для этих целей механических и физико-химических способов очистки.

В связи с этим в последнее время все больше внимание экологов привлекает биологический метод очистки от нефтяных загрязнений. Метод основан на применении микроорганизмов, способных использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода. Это дает возможность удалить нефть до фоновых значений при низких эксплуатационных затратах и простоте решения.

Среди мер, предпринимаемых с целью очистки окружающей среды от загрязнений, важное место занимает интенсификация микробиологических способов деструкции нефти. При этом предполагается активизация не только аборигенной микрофлоры загрязненных объектов, но и внесение биопрепаратов, содержащих штаммы активных нефтедеструкторов.

До сих пор поиск микроорганизмов, способных к эффективной деградации нефти, является актуальной задачей. Кроме того, добыча нефти осуществляется преимущественно на севере России, где репродуктивный период большинства микроорганизмов ограничивается 2-3 месяцами. Следовательно, встает вопрос о создании препаратов на основе микроорганизмов, жизнедеятельность которых возможна при пониженных температурах.

Цель:

Выделение и идентификация активных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, способных расти на среде, содержащей нефть и/или нефтепродукты, а также поиск и отбор микроорганизмов, осуществляющих свою жизнедеятельность в условиях низких температур.

Задачи:

1)  выделение чистых культур микроорганизмов из накопительной культуры, полученной из образца В4;

2)  определение, описание и анализ основных свойств (морфологических, физиолого-биохимических, биологических) выделенной культуры бактерий;

3)  идентификация на основании полученных данных выделенной культуры (по крайней мере, до рода).

Материалы и методы

Получение накопительной культуры

Накопительная культура создается для того, чтобы увеличить концентрацию целевых бактерий. Для наработки микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефти и нефтепродуктов, исследуемые субстраты вносят в элективную среду. Для углеводородокисляющих микроорганизмов используют солевую среду Цукамуры ((NH)₂SO₄ — 2,64 г.; KH₂PO₄ — 0,5 г.; MgSO₄ x 7H₂O — 0,5 г.;  H₂O — 980 мл.), а в качестве единственного источника углеводорода выступает нефть.

1.  В 10 мл среды Цукамуры помещают 1 г субстрата, хорошо перемешивают.

2.  Сверху наслаивают столбик нефти высотой в 2 мм.

3.  Пробирки выдерживают на качалке в течение 2 недель при комнатной температуре.

Определение числа живых бактериальных клеток в исходной накопительной культуре:

·  Приготовление разведений.

Для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений.

1. Стерильные пробирки со стерильными колпачками составляют в штатив и подписывают номером разведения. Одной и той же стерильной пипеткой на 5 мл вносят по 4,5 мл физиологического раствора в каждую пробирку.
2. Пробирку с накопительной культурой перед взятием из нее материала встряхивают, несколько раз ударяя указательным пальцем о ее дно.
3. Из середины пробирки с накопительной культурой отбирают 0,5 мл субстрата и вносят в первую пробирку с физиологическим раствором, не касаясь пипеткой поверхности жидкости в пробирке. После этого пипетка тут же выбрасывается. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают полученную в этом разведении суспензию и этой же пипеткой переносят 0,5 мл суспензии в следующую пробирку; далее повторяют те же манипуляции вплоть до приготовления последнего разведения (1:10 000 или 1:100 000). Важно помнить, что для приготовления каждого нового разведения необходимо использовать отдельную пипетку, иначе можно получить результат, в десятки раз превышающий истинный, что обусловлено адсорбцией клеток на стенках пипетки.

·  Посев на агаризованные чашки Петри.

В стерильные чашки Петри наливают по 20-30 мл расплавленной на кипящей водяной бане агаризованной среды. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Посев делают из разведений 1:1 000, 1:10 000 и 1:100 000

1.  Три чашки Петри с агаризованным бульоном (мясной бульон с добавлением 3% агара) подписывают. На дне указывают номер пробы, разведение, фамилию и дату.

2.  В середину каждой чашки наносят по 0,1 мл соответствующего разведения суспензии с микроорганизмами.

3.  Шпатель Дригальского стерилизуют фламбированием (шпатель окунуть в спирт и обжечь в пламени спиртовки, остудить) и тщательно растирают суспензию клеток, не надавливая на агар, а использую лишь силу тяжести  шпателя. Растирать следует равномерно во всех направлениях до полного впитывания нанесенного объема.