Фотометрические методы исследования. Устройство и принцип работы спектрофотометра, страница 17

^и — длина волны максимума излучения (флуоресценции);

?l„ — длина волны максимума поглощения.

Энергетический выход флуоресценции зависит от соотношения длин волн поглощения и излучения. Эта зависимость получила название закона С. И. Вавилова. Закон гласит, что энергетический выход флуоресценции увеличивается пропорционально возрастанию длины волны поглощения световой энергии до некоторой определенной длины волны, после чего энергетический выход начинает быстро уменьшаться. При этом квантовый выход остается постоянным в той же спектральной области, где энергетический выход пропорционален длине волны поглощения.

Интенсивность флуоресценции раствора (Фф) зависит от энергии светового потока (Фп)-поглощенной раствором, и квантового выхода флуоресценции (Вкв).

Интенсивность флуоресценции определяется формулой:

Фф=Фп-Вкв.

Учитывая закон Бугера — Ламберта — Вера, с некоторым приближением можно принять, что

Фф-Фо-К^С-1-Вкв,         где     Фо — световой поток, поступающий в раствор;

ка — коэффициент поглощения на данной длине волны 'k, зависящий от природы растворенного вещества;

С — концентрация флуоресцирующего вещества;

1 — толщина поглощающего слоя;

Вкв — квантовый выход флюоресценции. При больших разбавлениях раствора и поддержании постоянными значений Фо, K?i, 1, Вкв, что вполне реально при проведении измерений,

значение интенсивности флуоресценции будет пропорционально концентрации:

ФФ-К-С,       где        К — коэффициент пропорциональности.

Следует отметить, что на пропорциональность концентрации раствора и интенсивность флуоресценции, помимо других физико-химических факторов, влияет толщина флуоресцирующего слоя.

При малых концентрациях энергия возбуждающего света равномерно поглощается слоями флуоресцирующего раствора по всей его толщине, следовательно, и поток флуоресцирующего излучения, возникающего в единице объема раствора, будет пропорционален концентрации С по всему объему раствора.

В случае больших концентраций происходит интенсивное поглощение энергии возбуждающего света первыми слоями раствора и нарушается равномерность поглощения энергии по всему объему раствора, что, естественно, ведет к изменению суммарного потока флуоресценции.

Другая причина зависимости флуоресцирующей энергии от толщины слоя раствора заключается в том, что в ряде случаев спектры поглощения и флуоресценции одного и того же раствора перекрываются, и флуоресцирующая энергия на пути от глубинных слоев раствора к его поверхности частично поглощается самим раствором. Это явление носит название вторичного поглощения, или реабсорбции света.

Учитывая многочисленные физико-химические факторы отклонения от пропорциональности энергии поглощения и энергии флуоресценции от концентрации исследуемого раствора, при практических определениях концентрации раствора по световой энергии требуется предварительное построение градуировочных кривых. Градуиро-вочная кривая строится по результатам измерений флюоресценции растворов с известной концентрацией.

Основным достоинством флуоресцентных методов анализа по сравнению с другими фотометрическими методами является их высокая чувствительность.

Направления потоков световой энергии при флуориметрии показаны на рис. 3.45.

Устройство и принцип работы флуориметра

На рис. 3.46 представлена схема работы одноканального флуориметра с импульсным источником возбуждения.

Источником световой энергии возбуждения (1) является импульсная лампа. Диафрагма (2) ограничивает размеры светового потока. Оптическая система — конденсор (3) — формирует параллельный поток световой энергии, которая фильтруется полосовым фильтром (4). Фильтр пропускает световой поток с максимальной длиной волны ~k в диапазоне длин волн.