Приложение №2
Проблема быстрой и достоверной микробиологической диагностики хирургических гнойно-воспалительных процессов продолжает оставаться актуальной. Известно, что вызывающие их возбудители обладают широким спектром ферментативной активности. Ферменты микроорганизмов значительно ухудшают течение патологического процесса, ускоряют микробное распространение, инактивируют вводимые антибиотики и дезинтоксикационные средства. Вместе с тем, многие ферменты являются эпидемиологическими маркерами данных штаммов возбудителей.
Представляется целесообразным оценивать изучаемые штаммы по следующим ферментам: b-лактамаза, гиалуронидаза, ДНК-аза, протеаза, липаза, каталаза, гепариназа, АТФ-аза. Предлагаемые методы создают дополнительные возможности для быстрой этиологической диагностики возбудителей гнойно-воспалительных осложнений и заболеваний. Они не требуют сложного оборудования, дорогостоящих реактивов и могут быть использованы в лечебно-профилактических учреждениях всех уровней.
При взаимодействии 2-этокси -6,9-диаминоакридина лактата (риванола) с гиалуроновой к-той образуется сгусток обратно пропорционально деполимеризации гиалуроновой к-ты под действием фермента гиалуронидазы.
а) Приготовление препарата гиалуроновой к-ты.
Гиалуроновую к-ту получают, используя способ, предложенный в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Для этого собирают пупочные канатики в количестве 8-10 штук, разрезают и извлекают сосуды. Проводят 3- кратное отмывание дистиллированной водой. Далее кусочки просушивают на фильтровальной бумаге и тщательно измельчают ножницами. Добавляют 5-10 мл дистиллированной воды. Оставляют на ночь при t=40C. После этого их прогревают, доведя смесь до кипения. Фильтруют через шприц с ватным фильтром или 3-4 слоя марли. Далее пр-т замораживают в морозильной камере холодильника и хранят до употребления. Перед постановкой реакции его осветляют. Для этого проводят размораживание с последующим центрифугированием фильтрата при 8000 об/ мин. Полученный надосадок используют для основного опыта. Хранят в морозильной камере холодильника малыми порциями в замерзшем состоянии.
б) Определение качества препарата гиалуроновой к-ты
С этой целью в центрифужную пробирку с 0,1 мл гиалуроновой к-ты добавляют 0,05 мл физиологического раствора и 0,05 мл K-Na-фосфатного буфера, рН 7,0. Для приготовления буфера готовят 2 раствора - 0,067М р-р гидрофосфата Na (11,866 г двухводной соли на 1 л воды) и 0,067 М р-р дигидрофосфата калия (9,073 г на 1 л воды). Смешивают 61,2 мл первого и 38,8 мл второго р-ра. Инкубируют 2 ч в термостате при t-370C. По окончании инкубации на поверхность пробы наслаивают 0,01 мл свежеприготовленного 1% р-ра риванола (для получения последнего к 1 мл дистиллированной воды добавляют 10 мг риванола и растворяют при подогревании). Смесь оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Резко встряхивают до полного образования сгустка. При наличии выраженного риванолового сгустка пр-т считается годным для определения гиалуронидазной активности.
в) Приготовление взвеси микроорганизмов и определение гиалуронидазной активности.
Две-три петли чистой культуры выделенного золотистого стафилококка или несколько его колоний суспендируют в физиологическом растворе или используют суточную бульонную культуру. 50 мкл исследуемой суточной бульонной культуры или предварительно приготовленной суспензии вносят в центрифужную пробирку или в лунку планшета для иммуноферментного анализа разборного (лучше стеклянные пробирки с размерами близкими к лунке планшеты), туда же вносят 0,1 мл стандартизованного пр-та гиалуроновой к-ты и 0,05 мл буфера. В качестве отрицательного контроля используется буфер. Для положительного контроля желательно использовать штамм золотистого стафилококка с выраженной гиалуронидазной активностью. Смесь инкубируют в течение 2 часов в термостате при 370С. По окончании инкубации на поверхность проб наслаивают 0,01 мл 1% р-ра риванола. Смесь оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Резко встряхивают до полного образования сгустка. В случае положительного результата сгусток не образуется, и штамм считается продуцирующим гиалуронидазу. В случае сомнительного результата добавить в пробу 0,5-1 мл дистиллированной воды, сгусток виден лучше.
Принцип основан на удалении нераспавшегося гепарина бис-четвертичным аммониевым соединением с последующим определением уроновых к-т в супернатанте карбазоловым методом.
Готовится взвесь суточной культуры бактерий (1 петля в 1 мл физиологического р-ра). К 0,2 мл культуры добавляют 0,4 мл 1% р-ра гепарина. Смесь инкубируют в течение 24 часов при t-370С. После инкубации взвесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.
