филогенетической классификации бактерий наиболее информативным показателем является генетическое родство; при систематизации бактерий на основании генетического родства учитывают следующие показатели.
Способность обмениваться генетической информацией (например, посредством трансформации или конъюгации), возможной только между близкородственными организмами.
Состав нуклеотидных оснований (отношение Г-Ц:A-T пар).
Гомологию нуклеиновых кислот среди бактерий, выявляемую методом гибридизации.
«Золотой стандарт" в определении степени родства среди бактерий – установление гомологии в последовательности нуклеиновых кислот, однако, приобретение какого-либо свойства или признака может существенно изменять фенотип бактерий, поэтому подобный подход к систематике оказывается на практике неудобным.
Молекулярно-биологические признаки основываются на гомологии эталонной и исследуемой ДНК, о которой судят по процентному содержанию ГЦ-пар или по степени гибридизации этих молекул. Химическими методами после гидролиза ДНК и разделения свободных оснований можно узнать нуклеотидный состав. Наиболее часто используется определение точки плавления ДНК, при которой происходит ее денатурация в результате разрыва водородных связей, соединяющих две цепи. Разделение цепей сопровождается заметным увеличением оптической плотности при 260 нм. Если она достигает 90% и выше, говорят о близком генетическом родстве эталонной ДНК с выделенной из исследуемого микроба. Содержание Г+Ц в ДНК можно измерить также путем центрифугирования образца ДНК в градиенте CsCl и последующего определения оптическим методом его положения в градиенте, что позволяет точно установить величину плотности ДНК. Наибольшее разнообразие в содержании ГЦ наблюдается в группе прокариот, у которых эта величина колеблется от 30 до 75 мол.%, но среднее содержание ГЦ у многих различных штаммов микроорганизмов одного вида очень близки или идентичны. В то же время два организма с одинаковым средним нуклеотидным составом ДНК могут резко различаться в генетическом отношении.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот позволяет точно оценить генетическую гомологию штаммов. При быстром охлаждении раствора ДНК, подвергнутой тепловой денатурации, ее одиночные цепи остаются разделенными. Однако при температуре на 10-300С ниже t плавления происходит специфическая реассоциация «отжиг» комплиментарных цепей с образованием двухцепочечных молекул. При смешивании и обработке препаратов ДНК из двух родственных штаммов бактерий образуются молекулы гибридной ДНК. Один из этих штаммов выращивают в среде, содержащей дейтерий (D20) и его ДНК становится тяжелей. После смешивания, денатурации и отжига полученных образцов ДНК гибридные молекулы можно обнаружить путем центрифугирования препарата в градиенте CsCl, где они образуют полосы, занимающие промежуточное положение между «легкими» и «тяжелыми» молекулами двухспиральной ДНК. Может быть проведена аналогичная реассоциация между молекулами ДНК и РНК, реассоциация ДНК-рРНК представляет таксономический интерес.
Метод центрифугирования в градиенте плотности слишком громоздок и позволяет обнаружить реассоциацию только цепей с высокой гомологией. Поэтому более простой метод – это использование образцов ДНК с радиактивной меткой. На этом признаке основан метод молекулярных зондов, применяемый с диагностическими целями. Зонд представляет собой плазмидную ДНК с интегрированной в нее фрагментами ДНК, меченной контрастным веществом или радиоактивной меткой. Меченый зонд вместе с исследуемым материалом наносится на мембранный фильтр, после чего определяется степень его гомологии с исследуемой ДНК. Данный метод дает возможность быстро определить наличие в исследуемом материале ДНК тех или других микроорганизмов и поставить микробиологический диагноз заболевания.
Внутри бактериальных групп, в которых обнаружен перенос генетической информации посредством трансдукции, трансформации или конъюгации, можно изучать межвидовые или межродовые взаимоотношения на генетическом уровне с помощью соответствующего метода биологической гибридизации.
В идеале проведение генетических методов, например, ДНК-гибридизация - существенно более точный метод, однако он очень дорог и методически не доступен для широкого использования для видовой идентификации микроорганизмов.
Принципы систематизации бактерий в определителе Берджи
В практической бактериологии наибольшее распространение нашли принципы идентификации бактерий, основанные на различиях в строении клеточной стенки и отношении к окраске по Граму. Первое издание определителя бактерий Берджи было выпущено
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.
