Выделение чистой культуры микроорганизмов с последующей идентификацией выделенных бактерий по краткому определителю бактерий Берги

Министерство Образования и Науки Российской Федерации

Новосибирский Государственный Университет

Факультет Естественных Наук

Кафедра Молекулярной биологии

Отчётная работа

ВЫДЕЛЕНИЕИИДЕНТИФИКАЦИЯ

ЧИСТОЙКУЛЬТУРЫМИКРООРГАНИЗМОВ

                                                                                    Выполнила:

                                                                                Проверила: К.б.н.

Новосибирск 2007

Целью данной работы является выделение чистой культуры микроорганизмов с последующей идентификацией  выделенных бактерий по Краткому Определителю Бактерий Берги.

Ход работы

Была получена одна пробирка, содержащая примерно 4-5 мл молока жирности 1%. Молоко - питательная среда для молочнокислых бактерий, которые осуществляют брожение в присутствии кислорода.

Далее был сделан посев микроорганизмов из пробирки с физиологическим раствором на питательную среду. Посев был сделан с помощью стерильной стеклянной пипетки в радиусе 15 см от пламени горящей спиртовки.

Пробирка с молоком и молочнокислыми бактериями была помещена в термостат с установленной температурой 36 ⁰С на  7 дней.

Через неделю заметили, что молоко в пробирке скислось, есть белый осадок. Это можно объяснить тем, что под влиянием молочнокислых бактерий лактоза расщепляется на составляющие ее глюкозы – глюкозу и галактозу, которые затем специфическими ферментами превращаются в молочную кислоту. Свертывание молока происходит вследствие того, что молочная кислота отщепляет кальций от казеина, белок превращается в параказеин и выпадает в осадок.

Таким образом, можно сделать вывод, что накопительная культура получена. Следующим этапом является получение чистой культуры.

Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов до настоящего времени является метод, предложенный Р. Кохом. Принцип его заключается в получении чистой культуры из отдельного клона. Этот метод пригоден только для тех микроорганизмов, которые растут на плотных средах.

Был использован метод истощающих штрихов.

Для этого была использована чашка Петри с твердой агаризованной средой. Дно чашки Петри было разделено на 4 сектора.

Петлю накопительной культуры расштриховываем на поверхности агара в области первого сектора. Затем петля прокаливаем, открываем чашку Петри, штрих в первом секторе перечеркиваем и продолжаем штриховать второй сектор.

Аналогично поступаем с третьим и четвертым сектором. Все манипуляции производятся с выполнением условий стерильности.

После посева чашку помещаем в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образующаяся на крышке чашки Петри, не попала на поверхность агаровой пластинки.

Выдерживаем чашку Петри в термостате при 36 ⁰С   7 дней.

Через 7 дней смотрим на результат. Наблюдаем  много мелких колоний и две большего размера. Все колонии белого цвета. Определяем чистоту выделенной культуры.

Визуально установлено, что рост по штриху однороден.

Приготовили препарат фиксированных окрашенных клеток. Размер и форма клеток однородны.

Высеваем часть колонии на отдельную чашку Петри с плотной средой методом истощающего штриха. Ставим чашку в термостат на 7 дней.

Через неделю было получены клоны.

Визуальные характеристики полученных колоний:

Диаметр 0.3-0.5мм;

Профиль колонии - выпуклый;

Форма колонии – круглая;

Край колонии – волнистый;

Поверхность колонии – шероховатая;

Структура колонии – однородная.

Морфологические характеристики

Окраска по Граму

Окрашивание по Граму было проведено согласно методике. Установлено, что выделенная культура – грамотрицательные прямые палочки.

Физиолого-биохимические тесты

Тест на каталазу

На покровное стекло капаем каплю Н₂О₂. Прокаленной микробиологической петлёй касаемся чистой культуры, а затем одной капли Н₂О₂, ничего не происходит. Таким образом, исследуемая культура не обладает каталазной активностью. Тест на каталазу отрицательный.

Тест на дыхание

В столбик агара (6-7 мл) на микробиологической петле вносим (до середины) исследуемую культуру, соблюдая все правила стерильности. И помещаем  этот столбик в термостат (Т=36ºC) на 7 дней.

Тест на пастеризацию

Так как споры обладают высокой термоустойчивостью и после пастеризации остаются жизнеспособными, то если исследуемая культура даст рост после пастеризации, значит, она является спорообразующей. Из чашки Петри  микробиологической петлей берем пробу, которую опускаем в пробирку с физиологическим раствором (0,5-1 мл). Для теста помимо исследуемой культуры взяли контрольную группу №34 - она спорообразующая. Приготовили суспензию контрольной культуры. Помещаем пробирки с суспензиями исследуемой культуры на водяную баню на 10 минут при 80⁰С. Далее чашку Петри  делим на 4 сектора и с помощью пипетки капаем (2-3 капли) суспензии, как до пастеризации, так и после. Помещаем  эту чашку в термостат .

Через неделю установлено, что данная культура относится к факультативным  анаэробам. Тест на пастеризацию показал, что культура - неспорообразующая.

По Краткому Определителю Бактерий Берги идентифицировали полученную чистую культуру как сем. Lactobacillaceae, род Lactobacillus.

Список литературы:

1.  Методы изучения физиологии микроорганизмов. Методические указания. Новосибирск.: НГУ, 1990, с.41.

2.  Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1977, с.496.