Оценку субпопуляций лимфоцитов и анализ полученных данных проводили методом проточной цитофлуориметрии на цитофлуометре FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry, США). Для проведения исследования к 60 мкл свежей гепаринизированной крови добавляли 12 мкл конъюгированных с флуорохромом мышинных МкАТ к какому-либо поверхностному антигену. В нашей работе мы использовали МкАТ против поверхностных антигенов CD3, CD4, CD8, CD16 (NK-Cell), CD19 (B-lymph), HLA-DR фирмы Becton Dickinson Immunocytometry Systems, США. Полученную смесь инкубировали в течение 40 минут при комнатной температуре. После инкубации лизировали содержащиеся в пробе эритроциты. Для этого в пробу приливали 600 мкл 10% раствора формальдегида и инкубировали в течение 10 минут. После инкубации клетки дважды отмывали 0,9% раствором NaCl, центрифугируя их при 1000 об/мин в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл 0,9% раствора NaCl. Состоящая из одиночных клеток взвесь вводилась под давлением через форсунку в оптическую систему цитофлуометра. Струя клеточной взвеси занимает осевое положение в концентрически окружающем потоке бесклеточной обтекающей жидкости. Клетки проходят через сфокусированный на потоке лазерный луч. Свет лазера рассеивается и отражается клетками, а также возбуждает флуоресценцию связанного с ними флуорохрома. Рассеянные и отраженные лучи света наряду с эмиссией флуорохрома воспринимаются фотоэлектрическими детекторами. Возникающие электрические сигналы анализируются компьютером и могут либо преобразовываться немедленно, либо сохраняться до последующего изучения. На основе этих сигналов в проточном цитофлуометре происходит сортировка клеток. Сигналы после соответствующего усиления различными способами выводятся на экран дисплея. Каждая пересекающая луч лазера клетка дает на экране дисплея одну точку, положение которой определяется интенсивностью сигналов, поступивших на различные фотоэлектродетекторы.
Определение циркулирующих иммунных комплексов
Экзо- и эндогенные антигены (АГ) могут образовывать в организме иммунные комплексы (ИК) с соответствующими антителами (АТ). Этот процесс может стать причиной системной или органной патологии. Судьба циркулирующих ИК зависит от их величины и от индивидуальной активности фагоцитирующей системы. Повышение концентрации ЦИК наблюдается при системных, аутоиммунных, инфекционных и др. заболеваниях. Величина и состав растворимых ИК зависят от их относительной и абсолютной концентрации. Принято считать, что ИК, возникающие в условиях небольшого избытка АГ, представляют наибольшую опасность ввиду длительности их циркуляции и высокой комплементактивирующей способности.
Количество ЦИК в сыворотке крови определяли методом преципитации с 3,5% р-ром полиэтиленгликоля (ПЭГ). Метод основан на различной растворимости мономеров Ig в составе ИК при наличии в среде ПЭГ. Различные концентрации ПЭГ (2,5%, 3,5%, 7%, 10%) вызывают преципитацию различных по молекулярной массе и размерам ИК. Низкие концентрации ПЭГ осаждают комплексы крупных размеров, высокие концентрации вызывают преципитацию низкомолекулярных соединений. 3,5% ПЭГ осаждает наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров.
Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов
Определение количества иммуноглобулинов в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле. В основу этого метода положен метод Манчини, который основан на измерении кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая сыворотка. Диагностические моноспецифические сыворотки против IgG, IgM, IgA представляют собой сыворотки кроликов, овец или коз, гипериммунизированных Ig G, M, A человека и содержат АТ против тяжелых цепей соответствующих Ig. В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого Ig. Содержание Ig определяют относительно контрольной сыворотки крови человека с известной концентрацией Ig.
Анализы проводились в иммунологической лаборатории Краевой клинической больницы №1 г. Красноярска.
Все полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики, определялась среднеарифметическая (М) и средняя квадратичная ошибка (±m). Степень достоверности определяли по таблице Стьюдента. Различия оценивались как достоверные, начиная со значения Р<0,05. Математические расчёты проводились на компьютере Pentium-166 MMX в рамках программы.
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.