Иммунохимические методы анализа в клинической лаборатории

Иммунохимические методы анализа
в клинической лаборатории

И.А.Новикова

Иммунохимические методы исследований

Иммунохимические методы исследований – методы, основанные на специфической реакции взаимодействия антигена с антителом.

Cфера применения – для определения концентрации химических веществ, содержащихся в очень низких концентрациях в биологическом материале.

v Белки сыворотки крови: Иммуноглобулины, липопротеины

v Опухолевые маркёры: Раково-эмбриональный антиген (РЭА), альфа-фетопротеин и др.

v Гормоны

v Инфекционные маркёры: Нbs Ag,Anti-HIV

v Маркеры воспаления: Ревматоидный Фактор, С-Реактивный Белок

v Лекарственные вещества: Теофиллин, Дигоксин, Фенитоин и др.

Аналитические характеристики иммунохимических методов

Специфичность: 95-98%, позволяют дифференцировать химические вещества, имеющие очень схожую молекулярную структуру (например, тироксин  и трийодтиронин).

Чувствительность: до 10 ^{- 23} моль/л.

Принцип иммунохимических методов исследования

Основа технологии любого иммунологического метода исследования – реакция между антигеном и антителом.

Антиген -  вещество, распознающееся иммунной системой

Антитела (иммуноглобулины) -  белки, специфически реагирующие  с Аг.

Антиген подходит к  определенному антителу как «ключ к замку».

Общая схема строения иммуноглобулинов

Методы  иммунохимического  тестирования

·  Ag + At =  Комплекс AgAt.

•  Детекция антигена - тест-система должна иметь в своём составе соответствующее антитело (для определения концентрации дигоксина надо иметь в тест- системе антитела к нему)

•  Детекция антител -  тест-система должна содержать в своём составе соответствующий антиген (для определении антител  к НbSAg в тест системе должен содержаться синтетический HbSAg)

Антитела,  применяемые
 в  иммунохимических  тест-системах

•  Моноклональные антитела - получают от одной клеточной линии (клона) применением гибридомных технологий. Они обладают одинаковой специфичностью и связывающей способностью.

•  Поликлональные антитела  - смесь антител, полученных от различных клеточных линий. Получают из сыворотки иммунизированных животных. Антитела в такой смеси могут различаться по связывающей способности. 

Условия получения оптимальных результатов иммунохимического тестирования

Измерение результатов иммунохимической реакции

Зависит от характеристик антигена (размеры, количество, структура) и антител (авидность, специфичность).

v прямая детекция (определение группы крови; агглютинация бактерий, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.)

v непрямая детекция – используется, когда прямая визуализация реакции невозможна (невидима). Но если лиганд связан с твердой фазой, то реакция становится видимой (латексная агглютинация, пассивная гемагглютинации)

v детекция на основе меченого антигена или антитела применяют для обнаружения и определения антител (или антигенов) в низких концентрациях.

Реакция агглютинации

Реакция гемагглютинации

Реакция непрямой агглютинации

 Реакция Кумбса прямая

 Реакция Кумбса непрямая

Реакция преципитации

Реакция преципитации

 (от лат. praedpito — осаждать) — это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.

Реакция кольцепреципитации

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента

Реакция радиальной иммуннодифузии

Иммуноэлектрофорез

Иммуноанализ с использованием меченых антигенов или антител (immunoassay)

Принцип: образовавшиеся в ходе иммунохимической реакции или изолированные комплексы «антиген—антитело» соединяются с другими партнерами по реакции (т.н. «маркеры», «метки»), способствующими обнаружению или количественному определению исследуемого вещества. Метка может быть соединена с антителом или антигеном. Этот комплекс называется конъюгатом.

Метки:

Ø радиоактивные изотопы - радиоиммунные методы (РИА);

Ø ферменты - иммуноферментные методы (ИФА);

Ø люминесцирующие вещества - –иммунолюмисцентные методы;

Ø флюоресцирующие вещества -  иммунофлюоресцентные методы

Гомогенный и гетерогенный иммуноанализ

Гомогенный иммуноанализ -  об образовании комплекса АГ-АТ судят по появлению новых свойств метки (потеря активности). Нет необходимости в этапе их физического разделения.

Гетерогенный иммуноанализ - одна из фракций прикрепляется к твердой фазе, покрытой антигеном или антителом, поэтому другие фракции должны быть удалены (отмыты, отцентрифугированы). Используются 2 основных подхода – конкурентный и неконкурентный иммуноанализ.

Схема гомогенного ИФА

Конкурентный иммуноанализ

Конкурентный иммуноанализ (конкурентное связывание, сатурационный анализ)

•  Реактивы смешивают одновременно: исследуемое вещество (антиген) +  известное количество аналогичного меченого антигена + АТ к антигену → конкуренция меченого и немеченого антигенов за АТ. Несвязанную фракцию удаляют отмыванием. Учет: чем ниже концентрация антигена, тем больше меченого аналога свяжется с антителами.

•  Последовательная постановка реакции: исследуемый материал (антиген) + АТ в избытке, затем + меченый антиген. Несвязанную фракцию удалить отмыванием. Учет аналогично 1.

Конкурентный метод

Неконкурентный иммуноанализ

Метод «сэндвича»

Принцип: каждый белок имеет много детерминант — участков, к которым могут подсоединяться антитела, причем антитела также являются белками, которые могут связываться с соответствующими антителами.

Постановка: на твердой фазе (например, полистирольной ячейке) адсорбированы специфичные антитела +  биоматериал (АГ) → отмывание + избыток меченых АТ → отмывание → ферментативная реакция → учет.

Обязательное условие – в качестве аналита использовать вещества с достаточно большой молекулярной массой.

Гетерогенный иммуноферментный анализ сэндвич метод

Иммуноблоттинг

Блоттинг —перенос электрофоретически разделенных белков на иммобилизованные матрицы.

Иммуноблоттинг - + иммунохимический анализ разделенных фракций.

Преимущества - 

v получение на матрице идеальной копии электрофоретического разделения белков, присутствующих в геле;

v возможность проведения с образцом на матрице различных  аналитических процедур, что в гелях невозможно);

v возможность элюировать лиганды с иммобилизованного антигена

v Высокая чувствительность и специфичность метода

Используется для анализа белков, ДНК, РНК.

Разновидности блоттинга

Саузерн блоттинг—метод переноса фрагментов ДНК (с агарозы на нитроцеллюлозу под действием капиллярных сил). Далее они гибридизируются с радиоактивной РНК для проверки комплементарных последовательностей.

Норзерн блоттинг - перенос и анализ фрагментов РНК.

Вестерн блоттинг  - метод переноса фрагментов белка (с додецилсульфатполиакриламидных гелей на полосу чистой немодифицированной нитроцеллюлозы). 

Микроточечный анализ (биочипы)

Суть: на твердой подложке в точке (10 — 50 мкм) иммобилизованы антитела, специфичные для определенного аналита + исследуемая биожидкость → удаление остатка исследуемой пробы + «выявляющие» антитела, меченые (например, флуоресцентными метками) → детекция результата.  Каждая микроточка предназначена для отдельного аналита.

Преимущества:

Ø выполнение многопараметрового анализа большого количества различных веществ в биопробе объемом 0,1 —1,0 мл

Ø Очень высокая чувствительность