Иммуноферментный анализ. Характеристика реагентов и реакций, используемых в ИФА. Варианты оценки результатов анализа

Несмотря на указанные различия, принцип закрепления иммунных реагентов на твердой фазе - общий.

Большинство фирм-производителей  поставляют  уже  готовый  к проведению исследования иммуносорбент - твердую фазу с нанесенными антителами (антигенами).  Причем при производстве коммерческих тест-систем наиболее часто используют физическую сорбцию.

В отношении иммуносорбента для потребителей тест-систем важным  практическим моментом является строгое соблюдение рекомендаций поставщика по хранению тест-систем.  В  оптимальных  условиях адсорбированные антитела (антигены) в течение длительного времени остаются прочно связанными с носителем.  Длительное хранение сорбированной  твердой фазы при комнатной или более высокой температуре приводит не только к термической  инактивации  специфических реагентов, но и к их десорбции. Одним из проявлений таких изменений в прочности связывания может быть плохая воспроизводимость  в повторных пробах на одном планшете.  При работе с тест-системами, содержащими разборные планшеты,  необходимо оставшееся количество неиспользованных  стрипов опять упаковывать в хорошо закрытые полиэтиленовые пакеты и хранить при + 4° С.         

Виды конъюгатов    

Конъюгат представляет  собой  соединение,  в состав которого входит специфический реагент (антиген или  антитело)  и  метка  - фермент  (регулятор  активности фермента или простетическая группа). В качестве ферментативной метки было предложено использовать большое число энзимов. Практическое применение в тест-системах, в которых используются 96-луночные планшеты или шарики в пробирках, нашли три фермента.  Это пероксидаза хрена,  щелочная фосфатаза и b-D-галактозидаза. В паре с пероксидазой в  методе  ферментных каналов используется глюкозооксидаза.      Имеется много вариантов способа мечения - присоединения фермента к специфическому реагенту.  Их можно разделить на три группы:   

1. Ковалентное присоединение за счет образования  реакционно способных  групп на молекуле фермента и (или) специфического реагента с последующим образованием между ними химической связи.   

2. Специфическое присоединение за счет иммунных  взаимодействий между антителом и антигеном, которые приводят к образованию, так называемых "химерных" конъюгатов.  Причем в этих конструкциях антитела выступают и в роли антигенов. Например:      

         антитела [козьи против Ig кролика]      

               /         

      антитела [кролика против Ig мыши]              

              /          

      антитела [мыши против фермента]         

            /                       

     фермент    

3. Комбинированный способ,  сочетающий ковалентное присоединение и специфическое взаимодействие.  Например:     Авидин-Фермент + Биотинилированные специфические антитела.    

Меченые биотином  иммуноглобулины,  а  также  конъюгат  авидин-пероксидаза весьма стабильны.  Их реакционная способность остается  неизменной при хранении в течение 3 лет при +4° С.

В отечественных тест-системах и большинстве  зарубежных  используют  конъюгаты,  полученные  методом периодатного окисления, который обеспечивает ковалентное соединение фермента со  специфическим реагентом.  Метод  основан на окислении (перйодатом) углеводных остатков в составе молекулы фермента до альдегидных  групп и  их последующем взаимодействии с аминогруппами антител (антигенов).    В некоторых  случаях метят ферментом не целую молекулу иммуноглобулина, а F_ab-фрагмент.   

Развитие методов  генной  инженерии позволило получить конъюгат в готовом виде. С этой целью предварительно был выделен ген, кодирующий синтез фермента пероксидазы