Выделение и идентификация возбудителей гнойно-септических инфекций: Учебно-методическое пособие

жидкую среду и материал переводят в питательную среду вращением пробирки между ладонями.

Мягкие ткани измельчают в стерильной ступе с добавлением небольшого количества жидкой среды для анаэробов. Для посева используют несколько капель полученной эмульсии. Костные фрагменты погружают в жидкую среду, взбалтывают и высевают петлёй на плотную питательную среду. Оставшийся материал заливают жидкой средой для анаэробов в таком количестве, чтобы соотношение тканевого фрагмента и среды составляло 1:10.

После посева чашки и пробирки крышками вверх укладывают в анаэростат, Туда же ставят пробирку для контроля анаэробиоза. Проводят трёхкратную замену газа в анаэростате, помещают его в термостат и инкубируют при 37°С 2-7 суток.

2.  этап

Производят выделение чистой культуры. Для этого выросшие колонии просматривают с помощью бинокулярного микроскопа и по несколько колоний каждого типа рассеивают параллельно секторам на две чашки: с анаэробным гемагаром и 5% кровяным агаром. Из тех же колоний готовят мазки и окрашивают их. Также микроскопируют мазки из жидкой среды с первичным посевом. В случае обнаружения морфологических форм бактерий, не выделенных с плотной среды, делают высев на анаэробный гемагар и кровяной агар. Все чашки с гемагаром вновь помещают в анаэростат на 1-4 суток для обнаружения медленно растущих анаэробов, а чашки с кровяным агаром – в термостат.

3.этап

На следующий день (4 день исследования) определяют наличие роста на секторах агара, инкубированного в анаэробных и аэробных условиях. Колонии выросшие в аэробных условиях, идентифицируют по общепринятым схемам. Колонии выросшие только в анаэробных условиях, расценивают как облигатные анаэробные и приступают к их идентификации.

4 этап

Исследуемые культуры, идентифицируют до вида на основании результатов изучения культуральных, морфологических, биохимических свойств и чувствительности к антибиотикам. Порядок выполнения всех тестов должен быть чётко определён, все манипуляции следует выполнять быстро, чтобы предотвратить гибель анаэробных бактерий.

Чистую культуру исследуемого организма обильно засевают на следующие диагностические среды:

1.  на кровяной агар – для проверки на аэротолерантность и выявления микроаэрофильных бактерий;

2.  среду для контроля стерильности с бромтилмолблау – для выявления индолообразования между стенкой пробирки и пробкой укрепляют индикаторную бумажку;

3.  среду для контроля стерильности или обогащённую среду для контроля стерильности – для сохранения культуры и изучения характера роста на жидких средах;

4.  на анаэробный гемагар. Предварительно в нижней части чашки с анаэробным гемагаром делают Т-образный вырез агара. На поверхность засеянного агара накладывают диски с канамицином, полимиксином, ристомицином и желчью. Диски с эскулином и нитратами помещают на густо засеянные изолированные участки агара в нижней части чашки. Это позволит ограничить диффузию эскулина и нитратов и накопить культуру для изучения сахаролитической активности бактерий.

Засеянные среды 3, 4, 5, 6 помещают в анаэростат, среду 2 инкубируют в термостате, среду1 – в эксикаторе.

После этого приступают к подробному изучению чистой культуры анаэробов на гемагаре, описывают морфологию бактерий, наличие пигмента, проверяют каталазную активность, аэротолерантность, определяют ферментацию глюкозы и индолообразования, учитывают характер роста на жидких средах, учитывают результаты на чашке с диагностическими дисками, определяют протеолитическую активность, лецитовителазу и липазу, сахаролитическую