Биологическая активация заключается во взаимодействии аминокислоты с АТФ.
Пептидная связь довольно прочная, и ее можно разорвать, например, путем нагревания раствора белка в присутствии кислоты или щелочи, которые активируют гидролиз этой связи. Гидролиз пептидной связи в клетках ускоряется при помощи специальных ферментов. При гидролизе белки распадаются на составляющие их аминокислоты.
На свойствах аминокислот основаны методы их разделения из смеси. С практической точки зрения разделение аминокислот является необходимой процедурой в выяснении аминокислотного состава белков и пептидов. Наиболее популярными являются хроматографические методы.
Сам термин "хроматография" (греч. сhroma - цвет, graphein - писать) был введен в 1903г. русским ботаником Михаилом Цветом. Ему удалось разделить смесь пигментов листьев растений, используя твердые сорбенты. Современные методы разделения многих соединений базируются на хроматографии. При этом смесь веществ, подлежащих разделению, растворяется в жидкости или газовой среде, составляя "мобильную фазу". Она фильтруется через колонку, заполненную поросодержащим твердым матриксом, получившим название "стационарная фаза". Последний в некоторых типах хроматографии может быть ассоциирован с жидкостью.
Взаимодействие со стационарной фазой каждого из растворенных веществ приводит к задержке его прохождения через матрикс. Сила этой задержки зависит от свойств растворенного вещества. Поэтому если смесь, подлежащая фракционированию, начинает двигаться через колонку, на каждое из находящихся в ней соединений будут действовать задерживающие силы разной интенсивности. В результате такого воздействия постепенно смесь разделится на зоны, содержащие чистые вещества. Разделенные компоненты можно собрать в отдельные фракции для анализа или последующего фракционирования.
В зависимости от мобильной и стационарной фаз различают газожидкостную хроматографию (мобильная фаза - газ, стационарная - жидкость), жидкостно-жидкостную хроматографию (мобильная и стационарная фазы - несмешивающиеся жидкости, одна из которых связана с инертной твердой подложкой). Дальнейшая классификация хроматографических методов основана на природе преобладающего взаимодействия между стационарной фазой и разделяемыми веществами. К примеру, если сила, замедляющая продвижение вещества в твердой фазе, ионная по характеру, хроматография называется ионообменной; если же она является результатом адсорбции растворенных веществ на твердой стационарной фазе - хроматография будет адсорбционной.
Ионообменная хроматография. В процессе ионного обмена ионы, которые электростатически связаны с нерастворимым и химически инертным матриксом, обратимо замещаются ионами из раствора:
где R+A- - анионообменник, а В- - анионы из раствора. Соответственно катионообменник представляет отрицательно заряженные группы, которые обратимо связывают катионы.
Аминокислоты относятся к полиэлектролитам, поскольку они имеют положительный и отрицательный заряд. За счет этого они могут присоединяться к анионо- и катионообменникам в зависимости от суммарного электрического заряда. Принцип разделения аминокислот ионообменной хроматографией представлен на рис. 1.4.
Рис.1.4. Принцип разделения аминокислот ионообменной хроматографией
Различные аминокислоты взаимодействуют и связываются с ионообменниками с различной силой. Колонку промывают, постоянно добавляя жидкость (обычно, буферный раствор) на поверхность сорбента; соответственно, пройдя через твердую фазу, она вытекает из колонки. Этот процесс получил название "элюция". При этом те аминокислоты, у которых низкая связывающая способность к данному ионообменнику, будут продвигаться через колонку быстрее аминокислот с более высокой связывающей способностью (рис.1.5).
Рис.1.5. Сбор аминокислот, разделенных ионообменной хроматографией
Аминокислоты, которые более сильно связаны с ионообменником, можно вымыть, заменив элюирующий буфер на буфер с другим
Уважаемый посетитель!
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Ссылка на скачивание - внизу страницы.