Определение кинетических параметров ферментативного окисления глюкозы кислородом под действием глюкозооксидазы

Новосибирский Государственный Унивеситет

Факультет Естественных Наук

Кафедра Физической Химии

Лабораторная работа К-32

Определение кинетических параметров ферментативного окисления глюкозы кислородом под действием глюкозооксидазы

Студенты:

Громов Н. В.

Михальченко О.С.

Преподаватель:

Лузгин М.В.

НОВОСИБИРСК

2010 г.

Цель лабораторной работы – определение кинетических параметров реакции окисления глюкозы кислородом, осуществляемой ферментом глюкозооксидазой: константы Михаэлиса K_М и максимальной скорости реакции W_max.

Краткая теория.

Ферменты, катализаторы многочисленных химических превращений, происходящих в живой клетке, обладают двумя уникальными свойствами: высокой специфичностью по отношению к субстрату и типу реакции и эффективностью катализа, в миллионы раз превышающей эффективность всех известных гомогенных катализаторов химической природы (масштаб ускорений реакции в присутствии ферментов достигает 10⁸-10¹² раз).

Глюкозооксидаза (классификационное название фермента - β-D-глюкоза: кислород -оксидоредуктаза) осуществляет реакцию окисления β-D-глюкозы кислородом воздуха при температурах, близких к комнатной:

Фермент имеет четвертичную структуру: состоит либо из 2, либо из 4 субъединиц в зависимости от источника его выделения (бактерии, плесень). Каждая субъединица содержит 1 молекулу кофермента - флавинадениндинуклеотида (ФАД⁺), непосредственно участвующего в окислительно-восстановительных превращениях субстратов - глюкозы и кислорода.

Ферментативная реакция протекает по механизму "пинг-понга", т. е. стадийно, с последовательным присоединением сначала первого субстрата (глюкозы), затем второго субстрата (кислорода) без образования тройного фермент-субстратного комплекса.

Механизм действия глюкозооксидазы можно изобразить на схеме:

S - глюкоза; F₁ - глюконолактон; Е_ох - окисленная форма фермента; Е _геd - восстановленная форма фермента.

Суммарная реакция окисления глюкозы кислородом может быть представлена в виде:

В изученных условиях при постоянной начальной концентрации кислорода в растворе ферментативная реакция протекает по кинетическому закону Михаэлиса-Ментен:

где W - скорость ферментативной реакции, моль/л·с; W_max - максимальная скорость ферментативной реакции в изученных условиях, моль/л·V·c; К_м - константа Михаэлиса, моль/л; S₁ - концентрация субстрата глюкозы, моль/л.

Экспериментальная часть.

Необходимые для выполнения работы растворы:

1. 0,05 М калий-фосфатный буфер с рН = 6,0.

1,71 г калия фосфорнокислого однозамещенного растворили в дистиллированной воде в стакане объемом 200 мл. Довели рН полученного раствора до значения 6,0 на рН-метре с помощью раствора едкого натра. Перенесли содержимое стакана в мерную колбу на 250 мл, довели до метки дистиллированной водой.

2. KI-реактив.

0,83 г калия йодистого растворили в 8 мл буферного раствора рН 6,0, добавили 2 мл 9 %-го раствора молибдата натрия, перемешали.

3. 10% раствор β-D-глюкозы

1 гp β-D-глюкозы растворили в 10 мл буферного раствора.

Измерение скоростей ферментативной реакции проводили непосредственно в кювете спектрофотометра. Для этого в кювете смешивали приготовленные заранее реагенты в следующих пропорциях:

KI-реактив, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
10%-й раствор глюкозы, мкл	10	20	50	100	200	400	1000
Буферный раствор, мл	1,5	1,5	1,45	1,4	1,3	1,1	0,5

 Реакцию начинали добавлением аликвоты фермента, немедленно интенсивно перемешивали и записывали кинетическую кривую при постоянной длине волны l = 350 нм. Регистрация длилась 1-5 мин в зависимости от количества добавленного фермента. Каждый эксперимент воспроизводили 3 раза.

Из кинетических кривых определили начальную скорость окисления глюкозы, равную скорости выделения перекиси водорода в ферментатив­ной реакции. Концентрацию перекиси водорода опреде­лили по реакции с KI-реактивом (Н₂О₂ + 3I^─ + 2Н⁺→ 2Н₂O + I₃^─), интенсивный максимум поглощения при 350 нм с коэффициентом экстинкции ε = 2,5·10⁴ л/моль·см.

Получили зависимость начальной скорости реакции W₀, вы­раженной в мкмолях, выделившейся перекиси водорода в 1 мин на 1 мкл раствора фермента, от начальной концентрации субстрата в растворе S_o, моль/л.

So, моль/л	Wo, мкмоль/мин·мкл
0,00276	7,2616
0,00549	13,57733
0,0135	27,4554
0,02775	4,480
0,0555	6,608
0,111	10,38457

Начиная с концентрации 0,02775 использовали другой раствор глюкозооксидазы, обработку данных при разных растворах глюкозооксидазы провели отдельно.

Обработку данных проводили графически в об­ратных координатах Лайнувера-Берка 1/W_о - 1/S_o (1), а также Корниш-Боуден W_о - W_о/S_o (2).

                                                                                                            (1)

                                                                                                               (2)

Из полученных графиков вычислили константу Михаэлиса по глюкозе К_м и максимальную скорость реакции W_max.

Для концентраций 0,00276, 0,00549, 0,0135 M.

K_M=0,0396 моль/л

W_max=99 мкмоль/мин·мкл

W_max=95,4 мкмоль/мин·мкл

K_M=0,0333 моль/л

Для концентраций 0,02775, 0,0555, 0,111 M (другой раствор глюкозооксидазы).

W_max=16,56 мкмоль/мин·мкл

K_M=0,0762 моль/л

W_max= 17,537 мкмоль/мин·мкл

K_M = 0,0832 моль/л

Выводы

Были определены кинетические параметры реакции окисления глюкозы кислородом  спектрофотометрическим методом. Обработка экспериментальных данных проводилась  графически в об­ратных координатах Лайнувера-Берка и Корниш-Боуден. Получены кинетические параметры:

Для певого раствора глюкозооксидазы:

Из графика Лайнувера-Берка K_M = 0,0396 моль/л,W_max = 1,65 моль/л·с

Из графика Корниш-Боудена K_M = 0,0333 моль/л,W_max = 1,59 моль/л·с.

Для второго раствора глюкозооксидазы:

Из графика Лайнувера-Берка K_M = 0,0762 моль/л,W_max = 0,276 моль/л·с

Из графика Корниш-Боудена K_M = 0,0832 моль/л,W_max = 0,292 моль/л·с.

Для отдельных растворов глюкозооксидазы данные согласуются.