Поглощение и рассеяние света: Определение концентрации и молярной экстинкции вещества методом колориметрии, страница 11

На рисунке 1.4. показан спектр поглощения раствора гемоглобина в видимой области. Имеются три основных формы гемоглобина: дезоксигемоглобин (степень окисления иона железа 2+, нет лиганда), оксигемоглобин (степень окисления иона железа 2+, лиганд -  молекула кислорода), метгемоглобин (степень окисления иона железа 3+, лигандом является молекула воды. Лиганд – это любая малая молекула.). Каждая из форм гемоглобина характеризуется своим спектром поглощения (рис. 1.5.) оксигемоглобин имеет два пика при 541 нм и 577 нм, дезоксигемоглобин – один пик при 556 нм, а метгемоглобина небольшие пики при 500 нм и 630 нм. Как мы можем качественно заключить, в рассматриваемом нами образце гемоглобина (рис. 1.4), присутствуют оксигемоглобин и метгемоглобин.

Рис.1.5. Спектры электронного поглощения оксигемоглобина (1), дезоксигемоглобина (2), метгемоглобина (3). Фосфатный буфер; рН 7. где с – концентрация гемоглобина в молях, e - экстинкция форм гемоглобина в (М.см)-1, l- длина кюветы в см (обычно l =1 см).

Для количественных оценок необходимо знать величины экстинкций (e) форм гемоглобина на определенных длинах волн. Величина экстинкции равна поглощению (оптической плотности) определенного вещества, взятого в концентрации 1 моль (при l=1см). Учитывая, что оптическая плотность разбавленных растворов гемоглобина  определяется формулой:

                                                               (1.7)

Измерив оптическую плотность на двух длинах волн (577 и 500 нм),  легко найти концентрации форм гемоглобина (с_met  и c_oxy), решив систему двух уравнений:

                        (1.8)

В рассматриваемом случае (см. рис. 1.4): D₅₇₇=0.650, D₅₀₀=0.310, e_{577, oxy}=15.370 л^.мМ^-1.см^-1, e_577,met=4.1 л^.мМ^-1.см^-1, e_{500, oxy}=5.05 л^.мМ^-1.см^-1, e_500,met=9.04 л^.мМ^-1.см^-1.  

Подставляя величины в систему уравнений, получаем величины концентрации форм гемоглобина: С_oxy=4,2^.10^-5 М, С_met=1,08^.10^-5 М.

Подобным образом рассчитывают концентрации форм гемоглобина в гемолизатах крови пациентов в клинике.

3. Рассеяние света мутными средами.

Нефелометрия.

Рассеянием света называют явление, при котором распространяющийся в среде световой пучок отклоняется по всевозможным направлениям. Необходимое  условие для возникновения рассеяния света - наличие оптических неоднородностей, то есть областей с иным, чем основная среда, показателем преломления.

Различают два основных вида таких неоднородностей:

1) наличие  в однородном прозрачном веществе мелких инородных частиц. Такие среды являются мутными: дым (твердые частицы в газе), туман (капельки жидкости в газе), взвеси, эмульсии, твердые тела вроде перламутра, опалов, молочных стекол и так далее. Рассеяние света в мутных средах называют явлением Тиндаля;