Тетрадь для лабораторных работ по спецкурсу "Экспериментальная иммунология", страница 10

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 9

дата

Серологический метод: реакция связывания комплемента. Принцип реакции связывания комплемента. Компоненты реакции и их подготовка. Способы постановки РСК. Учет результатов. Области применения

Методический материал

Некоторые микроорганизмы, а точнее их антигены, индуцируют образование антител, обладающих способностью связывать комплемент, образуя вместе с соответствующим антигеном комплекс антиген-антитело-комплемент. Такие антитела называются комплементсвязывающими и их можно идентифицировать в серологической реакции - реакции связывания комплемента (РСК). Таким образом, РСК применяется преимущественно для диагностики инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать специфические искомому антигену антитела и регистрировать их титр.

РСК относится к сложным многокомпонентным серологическим реакциям. При постановке РСК in vitro создаются 2 системы: 1 - диагностическая, 2 - индикаторная.

1 - диагностическая система включает антиген (диагностикум), исследуемую сыворотку крови пациента, содержащую искомые антитела и комплемент. Все три ингредиента смешиваются в определенных пропорциях и инкубируются. Во время инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-комплемент в том случае, если в исследуемой сыворотке крови пациента присутствуют антитела к антигену диагностикума. При отсутствии антител комплемент остается свободным и иммунные комплексы антиген-антитело-комплемент не образуются. Внешне образование иммунных комплексов не проявляется никакими феномена вследствие особенностей взаимодействия антиген-антитело. Для индикации образования иммунных комплексов, т.е. для регистрации результатов РСК после инкубации в диагностическую систему добавляют индикационную систему.

2 - индикаторная система представляет собой суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами к ним же (гемолитическая система, приготавливаемая аналогично гемолитической системе для определения активности классического пути системы комплемента, см. лабораторную работу 6). Объединение двух систем и инкубация их при определенном режиме с последующим центрифугированием позволяет зарегистрировать результаты РСК по феномену задержки гемолиза.

Механизм индикации результатов РСК следующий:

1) антитела к диагностикуму в исследуемой сыворотке крови отсутствуют. РСК отрицательна. В данной ситуации во время инкубации компонентов 1-й (диагностической) системы не происходит образования иммунных комплексов. Комплемент находится в свободном состоянии. Добавление индикаторной системы - суспензии сенсибилизированных антителами эритроцитов барана - активирует имеющийся комплемент по классическому пути с последующей сборкой мембраноатакующего комплекса на поверхности эритроцитов. В результате эритроциты барана лизируются. Таким образом, отрицательная РСК сопровождается полным гемолизом: после центрифугирования на дне пробирок осадка нет, а все содержимое представляет собой прозрачный красно-оранжевый раствор;

2) антитела к диагностикуму в исследуемой сыворотке крови присутствуют. РСК положительна. В данной ситуации во время инкубации компонентов 1-й (диагностической) системы образуются иммунные комплексы. Комплемент находится в связанном с этими комплексами виде. Последующее добавление индикаторной системы не вызывает гемолиза, так как свободный комплемент отсутствует.

Учет РСК проводится по системе ++++:

- РСК - сопровождается полным гемолизом. что описано выше,

++++ РСК соответствует 100%-му связыванию антигена антителами и образованию комплексов антиген-антитело-комплемент. После центрифугирования в пробирке образуется осадок эритроцитов, супернатант прозрачный, бесцветный;

+++ РСК соответствует 75%-му связыванию антигена антителами, а значит определенная часть комплемента остается в свободном виде и активируется гемолитической системой. после центрифугирования на дне пробирки есть осадок эритроцитов, супернатант имеет слегка желтоватую окраску из-за лизиса части эритроцитов;

++ РСК соответствует 50%-му связыванию антигена антителами, а значит практически половина комплемента находится в свободном виде и вызывает гемолиз практически половины эритроцитов индикаторной системы. После центрифугирования в пробирке на дне есть осадок эритроцитов менее значительный, чем при +++ и ++++ РСК, а супернатант окрашен в красно-оранжевый цвет;

+ РСК - сомнительный результат, после центрифугирования на дне есть незначительный осадок эритроцитов, а супернатант окрашен как и при отрицательной РСК

Задание

Протокол

1. Составьте схему механизма РСК с учетом приведенного выше описания

2. Поставьте РСК по предложенной схеме. Зарисуйте результаты.

3. Определите нарастание титра антител в РСК, зарисуйте результаты, сделайте выводы

4. Предложите варианты ложноотрицательного и ложноположительного результата РСК

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 10

дата

Серологический метод: реакции преципитации. Феномен преципитации. Компоненты реакции. Варианты реакции преципитации, области их применения. Учет результатов

Методический материал

Реакция преципитации (РП) - это реакция взаимодействия антиген-антитело, проявляющаяся образованием белковых комплексов преципитатов в случае водорастворимого антигена. Принципиально, компоненты РП аналогичны компонентами РА, за исключением водорастворимости антигена.

Антиген в РП называют преципитиногеном, а антитела - приципитинами.

Преципитация проходит на границе раздела фаз, содержащих антигены и антитела. Чаще всего в качестве носителя применяется агарозный гель, в котором создаются оптимальные условия для равномерной диффузии компонентов реакции. При этом происходит образование белкового преципитата, отражающего факт связывания антигена с антителом. Предварительное проведение электрофоретического разделения белковых образцов (например, сыворотки крови) способствует повышению чувствительности реакции преципитации и ее специфичности, это позволило разработать методы иммуноэлектрофореза.

Области применения РП: 1) качественное определение неизвестного по известному в криминалистике (обнаружение белков крови, спермы и др. биологических материалов), судебной медицине; 2) количественное определение самых различных белков, включая иммуноглобулины разных классов, что проводится в иммунологии и др. областях медицины и биологии.

Задание

Протокол

1. Поставьте качественную реакцию кольцепреципитации для определения С-реактивного белка. зарисуйте результаты.

2. Поставьте реакцию простой радиальной иммунодиффузии по Манчини по предложенной схеме для определения концентрации иммуноглобулинов